Turbidimetric Limulus Amoebocyte Lysate Assay: טכניקה לזיהוי וכימות זיהום אנדוטוקסין בתרופות ננו

תקציר

מקור: Neun, B. W. et al., Detection of Endotoxin in Nano-formulations using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון וידאו זה מתאר את הפורמט הטורבידימטרי של בדיקת Limulus amoebocyte lysate, או LAL, כדי להעריך זיהום אנדוטוקסין בננו-פורמולציות דוקסורוביצין ליפוזומליות PEGylated. העכירות של התמיסה בעקבות התגובה של האנדוטוקסין עם מגיב LAL מסייעת להעריך את האנדוטוקסין בדגימה.

פרוטוקול

1. הכנת דגימות ננו-חלקיקים

1. הכינו את מדגם המחקר במים בדרגת ZAL.
2. אם רמת החומציות של הדגימה נמצאת מחוץ לטווח 6-8, התאימו את ה-pH באמצעות נתרן הידרוקסידי נטול פירוגן או חומצה הידרוכלורית.
3. שימוש במים בדרגת LAL מכין מספר דילולים של מדגם המחקר. יש לוודא שהדילול הגבוה ביותר אינו חורג מהדילול החוקי המרבי (MVD).

2. הכנת ריאגנטים נפוצים בין פורמטים LAL

1. לדלל מלאי נתרן הידרוקסידי מרוכז באמצעות מים מגיב LAL ללא פירוגן להכנת פתרון עבודה בריכוז של 0.1 N.
2. לדלל מלאי חומצה הידרוכלורית מרוכזת באמצעות מים מגיב LAL ללא פירוגן ולהכין פתרון עבודה בריכוז סופי של 0.1 N.
3. הכנת אנדוטוקסין סטנדרטי בקרה (CSE)
   1. להקים מחדש את CSE על פי תעודת הניתוח שסופקה על ידי היצרן.
      הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים לגבי מספר קטלוגי ויישום של נוסחת CSE נתונה בתבניות LAL שונות.
4. הכנת מגיב LAL
   1. להקים מחדש את מגיב LAL על פי תעודת הניתוח שסופקה על ידי היצרן.
      הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים לגבי מספר קטלוגי ויישום של נוסחת מגיב LAL נתונה בפורמט LAL שונה.

3. עכירות בדיקת LAL

1. הכנת תקני הכיול
   1. באמצעות שימוש ב-900 μL של מים בדרגת LAL ו-100 μL של CSE, הכינו דילולי ביניים רבים ככל הנדרש כדי לאפשר הכנת תקן כיול בטווח ריכוזים שבין 0.001 ל-1 EU/mL.
   2. תחילה יש לסמן את הצינורות ולהוסיף 900 μL של מים באיכות LAL לכל צינור. לאחר מכן הוסף 100 μL של 10 EU/mL פתרון להכנת תקן כיול עם ריכוז של 1EU/mL.
   3. חזור על הדילול הטורי פי 10 כמתואר לעיל כדי להכין שלושה תקני כיול נמוכים יותר. ודא שהוכנו ארבעה תקני כיול הנעים בין 0.001 ל- 1 EU/mL.
2. הכנת בקרות האיכות
   1. הכן בקרת איכות של 0.05 EU/mL על ידי שילוב של 50 μL של פתרון CSE 1 EU/mL עם 950 μL מים באיכות LAL.
3. הכנת בקרות עיכוב/שיפור (IEC)
   1. הכן את חברת החשמל בריכוז של 0.05 EU/mL על ידי שילוב של 25 μL של תמיסת CSE 1 EU/mL ו- 475 μL של ננו-חומר הבדיקה בדילול נתון.
4. הליך ניסיוני
   1. אפשרו למכשיר להתחמם על ידי הפעלתו כ-30 דקות מראש. הגדר את אורך גל הגילוי ל 660 ננומטר מכיוון שזה מתאים לעכירות LAL.
   2. היכנס על-ידי הקלדת שם המשתמש והסיסמה.
   3. פתח את התוכנה (רשימת חומרים) על ידי לחיצה על הסמל המתאים על מסך מחשב.
   4. בחר אסוף נתונים במסך הבית של התוכנה. הזן את מזהה הבדיקה ואת פרטי קבוצת הנתונים בשטח המתאים בכרטיסיה כללי במסך הבית.
   5. לחץ על הכרטיסיה חומרה. בחר את סוג המכשיר מתפריט נפתח.
   6. הגדר את אורך גל הגילוי ל 660 ננומטר מכיוון שזה מתאים לעכירות LAL על ידי בחירת שיטת העכירות RAL.
   7. ודא שמספר סידורי, מזהה מערכת ופרטי יציאה טורית מופיעים על המסך. לחץ על אישור. לחץ על אישור פעם נוספת כדי לאשר.
   8. הזן את מזהה הדגימה באותו סדר שבו נבדקת הדגימה. השתמש בלחצני ברירת המחדל כדי להזין את הפקד השלילי, העקומה הרגילה ודוגמאות הבדיקה.
   9. הכינו שפופרות כפולות לכל דגימה והוסיפו 200 μL (יחס בדיקה 4:1) או 100 μL (יחס בדיקה 1:1) של בקרה שלילית (מים), תקני כיול, בקרת איכות, IEC וננו-חלקיקי בדיקה לשפופרות זכוכית מסומנות מראש.
   10. הוסף 50 μL (יחס בדיקה 4:1) או 100 μL (יחס בדיקה 1:1) של מגיב LAL לבקבוקון הבדיקה הראשון, סובב אותו לזמן קצר והכנס לחריץ הבדיקה בקרוסלת המכשירים. אם נעשה שימוש ביחס של 1:1, נפח מגיב LAL הוא 100 μL.
   11. חזור על ההליך המתואר לעיל עבור דגימות אחרות. דוגמאות תהליך אחת בכל פעם.
        

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נתרן הידרוקסידי	סיגמא	S2770	בעת הצורך, הוא משמש כדי להתאים את pH הדגימה להיות בין 6-8
חומצה הידרוכלורית	סיגמא	H9892	בעת הצורך, הוא משמש כדי להתאים את pH הדגימה להיות בין 6-8
מגיב LAL	שותפי קייפ קוד	T0051	מגיב זה ניתן להשתמש עם בדיקת עכירות בלבד
תקן אנדוטוקסין בקרה	שותפי קייפ קוד	E0005	מגיב זה ניתן להשתמש עם עכירות בדיקות קריש ג'ל
מים בדרגת LAL	שותפי קייפ קוד	WP0501	מגיב זה יכול לשמש עם כל פורמט LAL
מאגר גלוקשילד	שותפי קייפ קוד	GB051-25	משמש למניעת תגובה חיובית כוזבת מבטא-גלוקנים
צינורות חד פעמיים לדילול זכוכית ללא אנדוטוקסין 12 x 75 מ"מ	שותפי קייפ קוד	TB240	צינורות אלה ניתן להשתמש עם כל שלושת הבדיקות
צינורות תגובה חד פעמיים ללא אנדוטוקסין מזכוכית 8 x 75 מ"מ	שותפי קייפ קוד	TK100	צינורות אלה יכולים לשמש עם עכירות בדיקות כרומוגניות
טיפים ללא פירוגן עם נפחים 0.25 ו 1.0 מ"ל	ריינין	PPT25, PPT10	טיפים ופיפטות עשויים לספוח אנדוטוקסין ולשחרר שטיפות אשר מפריעות לבדיקת RAL. טיפים אלה של RAININ משמשים מכיוון שהביצועים האופטימליים שלהם בבדיקת LAL אומתו ואושרו
צינורות מיקרוצנטריפוגות ללא פירוגן, 2.0 מ"ל	אפנדורף	22600044	ניתן להשתמש בחומרים מתכלים מקבילים אחרים
קומביטיפס בתשלום פירוגן, 5 מ"ל	אפנדורף	30089669	ניתן להשתמש בחומרים מתכלים מקבילים אחרים
חזור על פיפטור	אפנדורף	4982000020	ניתן להשתמש בחומרים מתכלים מקבילים אחרים
מיקרו-צטריפוגה	כל מותג		ניתן להשתמש בכל מותג
מקרר, 2-8 מעלות צלזיוס	כל מותג		ניתן להשתמש בכל מותג
מערבולת	כל מותג		ניתן להשתמש בכל מותג
מקפיא, -20 מעלות צלזיוס	כל מותג		ניתן להשתמש בכל מותג
Pyros Kinetix או Pyros Kinetix קורא Flex	שותפי קייפ קוד	PKF96	ניתן להשתמש במכשירים אחרים. עם זאת, ריאגנטים LAL ותקני אנדוטוקסין המשמשים בבדיקה זו עשויים לדרוש אופטימיזציה. כאשר נעשה שימוש במכשור אחר, פנה ליצרני המכשירים וערכות LAL לקבלת הוראות