בדיקת ג'ל-קריש לימולוס אמבוציטים ליזט: שיטה לזיהוי אנדוטוקסין חיידקי בפורמולציות ננו-חלקיקים

תקציר

מקור: Neun, B. W. et al., Detection of Endotoxin in Nano-formulations using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מתאר בדיקת קריש ג'ל כדי לקבוע את נוכחותם של אנדוטוקסינים חיידקיים בננו-פורמולציות באמצעות Limulus Amoebocyte Lysate שמקורו בתאי הדם של סרטני פרסה. הבדיקה מסייעת לבדוק זיהום אנדוטוקסין של מוצרים פרמצבטיים, כולל פורמולציות מבוססות ננו.

פרוטוקול

1. הכנת דגימות ננו-חלקיקים

1. הכינו את דגימת המחקר במים ברמת LAL.
2. אם רמת החומציות של הדגימה נמצאת מחוץ לטווח 6-8, התאימו את ה-pH באמצעות נתרן הידרוקסידי נטול פירוגן או חומצה הידרוכלורית.
3. באמצעות מים בדרגת LAL, להכין מספר דילולים של מדגם המחקר. יש לוודא שהדילול הגבוה ביותר אינו חורג מהדילול החוקי המרבי (MVD).

2. הכנת ריאגנטים נפוצים בין פורמטים LAL

1. לדלל מלאי נתרן הידרוקסידי מרוכז באמצעות מים מגיב LAL ללא פירוגן להכנת פתרון עבודה בריכוז של 0.1 N.
2. לדלל מלאי חומצה הידרוכלורית מרוכזת באמצעות מים מגיב LAL ללא פירוגן ולהכין פתרון עבודה בריכוז סופי של 0.1 N.
3. הכנת אנדוטוקסין סטנדרטי בקרה (CSE)
   1. להקים מחדש את CSE על פי תעודת הניתוח שסופקה על ידי היצרן.
      הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים לגבי מספר קטלוגי ויישום של נוסחת CSE נתונה בתבניות LAL שונות.
4. הכנת מגיב LAL
   1. להקים מחדש את מגיב LAL על פי תעודת הניתוח שסופקה על ידי היצרן.
      הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים לגבי מספר קטלוגי ויישום של נוסחת מגיב LAL נתונה בפורמטים שונים של RAL.

3. ג'ל-קריש LAL

הערה: בדיקה זו מזהה נוכחות של אנדוטוקסינים בדגימה בהתבסס על תצפית חזותית וזיהוי של קריש בצינור התגובה. שלבי הניסוי מתוארים להלן. השתמש בגיליון ספסל כדי להקליט את התוצאות. גיליון ספסל זה אינו חובה, ודרכים אחרות לרישום תוצאות הבדיקה מקובלות גם הן. דוגמה לגיליון ספסל כזה מסופקת בחומרים משלימים לנוחיות הקורא. Lambda (l) היא הרגישות של בדיקת קריש ג'ל והוא 0.03 האיחוד האירופי / מ"ל.

1. תייגו כמה שפופרות תגובה לפי הצורך כדי להכיל את מספר דגימות הבדיקה שנותחו. עיין בגיליון הספסל לקבלת פרטים אודות מספר העותקים המשוכפלים הנמצאים בשימוש בשלב 1, שלב 2 ושלב 3 של הבדיקה.
2. Aliquot 100 μL של מים, בקרות, או דגימת בדיקה לכל צינור.
3. הכינו CSE כך שהריכוז הסופי יהיה שווה ל-4λ.
4. שלב 100 μL של התקן שהוזכר לעיל עם 100 μL של מים או מדגם הבדיקה כדי להשיג את הריכוז הסופי של CSE של 2λ. חזור על הפעולה שלוש פעמים נוספות כדי להשיג למבדה וחצי למבדה ורבע למדא.
5. ודא כי הטמפרטורה באמבט המים היא 37 °C (77 °F).
6. מוסיפים 100 מיקרוליטר ליזט לכל מבחנה, מערבלים לזמן קצר, ומניחים את המדף עם כל הצינורות לתוך אמבט המים למשך שעה אחת.
7. הפוך את הצינור בתנועה חלקה.
8. רשום תוצאות באופן ידני באמצעות "+" (קריש יציב) או "-" (ללא קריש דם או קריש רופף) על גיליון הספסל.
9. המשך עם הניתוח על פי USP BET 85; השתמש בגיליון הספסל כחומר תומך.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מגיב LAL	שותפי קייפ קוד	G5003	מגיב זה הוא ספציפי לבדיקת קריש הג'ל
תקן אנדוטוקסין בקרה	שותפי קייפ קוד	E0005	מגיב זה ניתן להשתמש עם עכירות בדיקות קריש ג'ל
נתרן הידרוקסידי	סיגמא	S2770	בעת הצורך, הוא משמש כדי להתאים את pH הדגימה להיות בין 6-8
חומצה הידרוכלורית	סיגמא	H9892	בעת הצורך, הוא משמש כדי להתאים את pH הדגימה להיות בין 6-8
מים בדרגת LAL	שותפי קייפ קוד	WP0501	מגיב זה יכול לשמש עם כל פורמט LAL
חיץ Glucashield	שותפי קייפ קוד	GB051-25	משמש למניעת תגובה חיובית כוזבת מבטא-גלוקנים
צינורות חד פעמיים לדילול זכוכית ללא אנדוטוקסין 12 x 75 מ"מ	שותפי קייפ קוד	TB240	צינורות אלה ניתן להשתמש עם כל שלושת הבדיקות
צינורות תגובה חד פעמיים מזכוכית נטולת אנדוטוקסינים 10 x 75 מ"מ	שותפי קייפ קוד	TS050	צינורות אלה מיועדים לשימוש עם בדיקת קריש ג'ל
טיפים ללא פירוגן עם נפחים 0.25 ו 1 מ"ל	ריינין	PPT25, PPT10	טיפים ופיפטות עשויים לספוח אנדוטוקסין ולשחרר שטיפות אשר מפריעות לבדיקת RAL. טיפים אלה של RAININ משמשים מכיוון שהביצועים האופטימליים שלהם בבדיקת LAL אומתו ואושרו
צינורות מיקרוצנטריפוגות ללא פירוגן, 2.0 מ"ל	אפנדורף	22600044	ניתן להשתמש בחומרים מתכלים מקבילים אחרים
קומביטיפס בתשלום פירוגן, 5 מ"ל	אפנדורף	30089669	ניתן להשתמש בחומרים מתכלים מקבילים אחרים
חזור על פיפטור	אפנדורף	4982000020	ניתן להשתמש בחומרים מתכלים מקבילים אחרים
מיקרו-צטריפוגה	כל מותג		ניתן להשתמש בכל מותג
מקרר, 2-8° צלזיוס	כל מותג		ניתן להשתמש בכל מותג
מערבולת	כל מותג		ניתן להשתמש בכל מותג
מקפיא, -20 מעלות צלזיוס	כל מותג		ניתן להשתמש בכל מותג
אמבט מים, 37°C	כל מותג		ניתן להשתמש בכל מותג, עם זאת, חשוב לכבות את זרימת המים או להשתמש באמבט מים שאינו מסתובב מכיוון שזרימת המים תשפיע על היווצרות קריש הדם ותוביל לתוצאות שליליות שגויות