$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הפעלת צלחת ערכת הבדיקה
- הפעל את מסנן 96 הקידוחים (המכיל CPH-xylan כחול) צלחת בדיקה (רשימת חומרים) על ידי הוספת תמיסת הפעלה של 200 μl (המתקבלת עם הערכה) לכל באר, ולאחר מכן דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר ללא תסיסה.
- החל ואקום באמצעות סעפת ואקום (עם בלוק הספייסר בפנים וכל צלחת סטנדרטית ושקופה של 96 בארות כצלחת איסוף) כדי להסיר את תמיסת ההפעלה הקיימת. ניתן גם להשתמש בצנטריפוגה במהירות של 2,700 x גרם למשך 10 דקות לשלב זה במקום סעפת הוואקום.
- שטפו את מצעי ה-CPH על ידי הוספת 100 μl מים סטריליים והפעילו ואקום (או כוח צנטריפוגלי) כדי להסיר את המייצב. חזור על שלב זה פעמיים נוספות והלוחות מוכנים כעת לשימוש.
2. תגובת אנזים
NOTE: תמיד לכלול את החיץ בלבד כבקרה שלילית ואם אפשר אפיינו אנזימים בעבר כבקרות חיוביות. השתמש במספר מתאים סטטיסטית של עותקים משוכפלים. מצעי CPH יציבים בין pH 3.0 ל-10.0 והנפח הכולל של תמיסת אנזים קצה החיץ בכל באר לא יעלה על 180 מיקרוליטר. ניתן להשתמש גם בתמצית צמחים או ציר תרבית במקום בתמיסת אנזימים מטוהרים.
- הוסף 150 μl 100 mM נתרן אצטט חוצץ, pH 4.5, ו 5 μl תמיסת אנדו-צלולאז (לריכוז סופי של 1 U / ml) לכל באר של צלחת ערכת המבחן.
- הניחו את צלחת המוצר (צלחת שקופה התואמת לקורא לוחות המיקרוטיטר) מתחת לצלחת ערכת הבדיקה כדי לאסוף דליפה פוטנציאלית מלוחית התגובה במהלך הרעידה.
- יש לדגור על צלחת ערכת הבדיקה בטמפרטורה של 25°C למשך 30 דקות בשייקר אופקי במהירות 150 סל"ד.
הערה: ערבוב התגובה בצלחת ערכת הבדיקה במהלך הדגירה חיוני להשגת תוצאה עקבית וניתנת לשחזור. מצעי CPH יציבים עד 90 °C. יש להגדיל את זמן הדגירה עד 24 שעות בעת בדיקת תרבית מרקים המכילים ריכוזי אנזימים לא ידועים עם סובסטרטים CPH. שימו לב שזמני הדגירה המתאימים תלויים בפעילות האנזים, אך באופן כללי, אם אין פעילות ניתנת לגילוי תוך 24 שעות, סביר להניח שהאנזים לא יפרק את המצע הנבדק. אנזים פעיל מפרק את הרב-סוכרים הכרומוגניים הבלתי מסיסים של מצע ה-CPH לאוליגוסכרידים כרומוגניים מסיסים, הנראים כסופרנטנטים צבעוניים.
- הניחו את צלחת המוצר הנקייה בתוך סעפת הוואקום עם בלוק הספייסר בפנים.
- מניחים את צלחת ערכת הבדיקה על גבי ולהחיל ואקום (לחץ שלילי מקסימלי של -60 kPa). ניתן גם להשתמש בצנטריפוגה במהירות של 2,700 x גרם למשך 10 דקות
הערה: התסנין המכיל את האוליגוסכרידים הצבעוניים כתוצר התגובה נמצא כעת בצלחת המוצר לניתוח נוסף.
3. איתור וכימות
- בדוק כי נפח הנוזל בכל באר של צלחת המוצר הוא בערך זהה על ידי בדיקה חזותית.
- קרא את הספיגה של צלחת האיסוף ב- 595 ננומטר עבור CPH-xylan כחול באמצעות קורא לוחות.
- בעת ביצוע ניתוח נתונים, הפחת את ערכי הבקרה השליליים של המאגר בלבד מהערכים מהבארות שבהן נוסף אנזים. חשב את הערך הממוצע ואת שגיאת התקן של אמצעים (SEM) מבארות ההעתקה.