בדיקת אנזימים כרומוגנית בלתי מסיסה מבוססת ביומסה: בדיקה להערכת פעילות הפירוק של אנזימים מפרקים ביומסה צמחית

תקציר

מקור: Schückel, J., et al. סינון בתפוקה גבוהה של אנזימים מפרקים פחמימות באמצעות ערכות חדשניות לבדיקת מצעים כרומוגניים בלתי מסיסים. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים בדיקה לסינון אנזימים יעילים בפירוק רב-סוכרים מורכבים בביומסה צמחית באמצעות ביומסה כרומוגנית בלתי מסיסה או ICB. האנזימים מבצעים הידרוליזה של ICB כדי לשחרר אוליגוסכרידים מסיסים הקשורים לצבע, ופעילות האנזים מוערכת על ידי ניתוח קולורימטרי של תוצר התגובה.

פרוטוקול

1. בדיקה כרומוגנית עם מצעי ICB בפורמט 96 בארות

1. תגובת אנזים
   1. הוסף את 150 μl 100 mM נתרן אצטט חוצץ, pH 4.5 ו 5 μl 31 U/ml תמיסת endo-xylanase לכל באר של צלחת ערכת הבדיקה המכילה קש ICB-חיטה אדום (ריכוז האנזים הסופי בבאר: 1 U/ml).
      הערה: לוחות ערכת הבדיקה (לוחות סינון 96 בארות המכילות מצעי ICB) מיוצרות כמתואר בספרות (ראה רשימת חומרים). מצעי ICB יציבים במאגרים עם טווח pH בין pH 3.0 ל 10.0. תמיד לכלול חיץ בלבד כבקרה שלילית, אנזימים מסחריים כבקרה חיובית ולהשתמש במספר מתאים סטטיסטית של העתקים.
      1. אין להפעיל את מצעי ICB כמו לוח המצע CPH, אלא להסיר את המייצב על ידי שטיפה שלוש פעמים עם 100 μl מים ולאחר מכן סינון ואקום או צנטריפוגה.
   2. שים את צלחת המוצר מתחת לצלחת המצע כדי לאסוף כל דליפה פוטנציאלית מצלחת המצע במהלך הרעידה.
   3. לדגור על התגובה ב 25 ° C רועד ב 150 סל"ד במשך 2 שעות.
      הערה: אנזים פעיל מפרק את הרב-סוכרים הכרומוגניים הבלתי מסיסים במצע ICB לאוליגוסכרידים מסיסים, הנראים כסופר-נטנטים צבעוניים. מצעי ICB יציבים עד 90 °C. יש להגדיל את זמן הדגירה עד 24 שעות אם משתמשים באנזימים לא מטוהרים כגון מרקי תרבית.
   4. הניחו את צלחת המוצר בתוך סעפת הוואקום עם בלוק הספייסר בפנים.
   5. הניחו את צלחת ערכת הבדיקה על גבי והפעילו ואקום (לחץ שלילי מרבי של -60 kPa) או השתמשו בצנטריפוגה כדי לסנן את המוצר מצלחת ערכת הבדיקה לבאר של צלחת המוצר.
      הערה: התסנין המכיל את האוליגוסכרידים הצבעוניים כתוצר תגובה נמצא כעת בצלחת האיסוף לניתוח נוסף.

2. איתור וכימות

1. בדוק כי נפח הנוזל בכל באר של צלחת האיסוף הוא בערך זהה על ידי בדיקה חזותית.
2. קרא את ספיגת צלחת האיסוף ב- 517 ננומטר עבור קש חיטה ICB אדום באמצעות קורא צלחות.
3. בעת ביצוע ניתוח נתונים - החסר את המאגר - רק ערכי בקרה שליליים מהערכים מהבארות שבהן נוסף אנזים. חישוב הערך הממוצע ושגיאת התקן של אמצעים (SEM) מבארות השכפול.
   הערה: במקרה של סינון אנזימים לא ידועים, אנו מציעים לבצע סדרת דילול על מנת לקבל נתונים מפורטים יותר על הטווח הדינמי של פעילות האנזים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחות ערכת Assay	גליקוספוט		צלחות ערכת בדיקה מותאמות אישית
בלוק ספייסר צלחת מקלט 350 מ"ל לסעפת ואקום	תאגיד פאל	5015	בלוק מרווח
צלחת מסנן HV MultiScreen 96-well, 0.45 מיקרומטר, שקוף, לא סטרילי	מיליפור	MSHVN4510	צלחת Assay
96-באר microplates, פוליפרופילן	גריינר ביו-וואן	651201	צלחת איסוף לאחר שטיפת המצעים
Nunc MicroWell 96-Well Microplates	תרמו סיינטיפיק	269620	צלחת מוצר
משאבת דיאפרגמה MZ 2 NT	Vacuubrand	732000	משאבת ואקום בשימוש עם סעפת הוואקום
Infors HT Ecotron	Infors HT	4950132 (Buch &; Holm)	שייקר אופקי
SpectraMax M5	התקנים מולקולריים	10067-750 (VWR)	קורא ספיגת צלחות 96 בארות
סעפת ואקום	תאגיד פאל	5017	סעפת ואקום
endo-β-1,4-xylanase M4 (Aspergillus niger)	מגה-אנזים	E-XYAN4	קסילנאז [xyl]