1. בדיקת ציטוטוקסיות: הגדרה
- הכינו תמיסות של תרכובות ריבית בריכוזים הרצויים במדיה המתאימה (ללא סרום או 1, 2.5 או 5% FBS RPMI-1640).
- כדי למדוד את ציטוטוקסיות של תרכובת בודדת (למשל, כדי לקבוע מינונים יעילים), הכינו תרכובות בריכוז סופי פי 2.
- כדי למדוד את ציטוטוקסיות של שילובי תרכובות, הכינו תרכובות בריכוז סופי פי 4.
- הכן בקרות ממס בלבד על ידי ערבוב אותה כמות של ממס עם המדיום המתאים. לדוגמה, אם בודקים תרכובות מומסות ב-DMSO ובמתנול, יש לבצע בקרה באמצעות ממס בלבד עבור כל ממס.
- לאסוף תאים מן צלחת תרבית או בקבוק לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
- מעבירים 10 μL של תרחיף תאים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה וכתם עם 10 μL 0.4% טריפאן כחול. השתמש בהמוציטומטר כדי לספור תאים בני קיימא ולא בני קיימא עבור כל מקור תא.
- תאי גלולה ב 200 גרם במשך 5 דקות. לשאוף או decant supernatant.
- גלולת תא השהיה מחדש במדיה המתאימה לבדיקה (ללא סרום או 1, 2.5, 5% FBS RPMI-1640) בצפיפות תאים של 3*105 תאים/מ"ל
הערה 1: צפיפות תאים של 3*105 תאים / מ"ל מספקת צפיפות זריעה של 15,000 תאים / באר. צפיפות הזריעה היא פרמטר חשוב ובאופן אידיאלי יש להגדיר אותה מראש לפני הניסוי. צפיפות הזריעה צריכה לקחת בחשבון 1) גודל תא – בדרך כלל תאים גדולים יותר נזרעים בצפיפות נמוכה יותר; 2) משך הטיפול – תאים נזרעים בדרך כלל בצפיפות נמוכה יותר לניסויים שיימשכו זמן רב יותר, 3) קצב חלוקת תאים – תאים עם קצב חלוקה גבוה יותר נזרעים בצפיפות נמוכה יותר. דוגמאות ספציפיות לצפיפויות זריעה אופטימליות: תאי K562, גדולים יותר, משך 24 שעות – 10,000 תאים לבאר; תאי MOLM-13, בגודל בינוני, טיפול 24 שעות – 15,000/טוב; תאי MOLM-13, טיפול של 48 שעות – 8,000/טוב; תאי דם חד-גרעיניים היקפיים קטנים ובריאים (PBMCs), טיפול 24 שעות – 50,000 / טוב; תאי AML ראשוניים, טיפול 24 שעות – 15,000-20,000/well.
הערה 2: נוכחות FBS בתקשורת עשויה להשפיע על פעילות התרכובות. הפחתת הריכוז של FBS עשויה להפוך את תוצאות הבדיקה לפשוטות יותר לפרשנות, אך היא גם מפחיתה את הדיוק הפיזיולוגי.
- זרע 50 μL של תרחיף תאים משלב 1.5 לתוך כל באר של צלחת 96 באר באמצעות פיפטה רב ערוצית.
- הוסף תרכובות באופן הבא:
- לבדיקות תרכובת בודדת, הוסף 50 μL של תמיסת תרכובת 2x לכל באר. עבור בארות בקרת ממס, להוסיף 50 μL של מדיה הבדיקה המכילה את הממס בריכוז 2x.
- לבדיקות משולבות, הוסיפו 25 מיקרוליטר מכל אחת מהתרכובות (4x תמיסות) לכל באר. עבור בארות בקרת תרכובת יחידה, הוסף 25 μL של תמיסת תרכובת 4x ו- 25 μL של אמצעי בדיקה. עבור בארות בקרת ממס, הוסף 50 μL של אמצעי בדיקה או אמצעי בדיקה המכילים את הממס.
הערה 1: הריכוז הסופי של DMSO לא יעלה על 0.5%.
הערה 2: מומלץ להוסיף את המדיה המכילה את התרכובות כאשר הפיפטה נוגעת בדופן של כל באר בשל נפח נמוך.
- טפחו בעדינות על הצלחת כדי להבטיח ערבוב של תכולת הבארות.
- דגרו על צלחות בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה לחה של 5% CO2 למשך זמן מתאים, למשל, 24 שעות.
2. בדיקת ציטוטוקסיות: צביעה עם Hoechst 33342 ופרופידיום יודיד
- הכינו תמיסת צביעה 10x. פתרון זה צריך להיות מוכן טרי לפני כל ניסוי, זה לא יכול להיות מאוחסן. יש לקבוע את ריכוזי הצבע הסופיים לפני הניסוי.
- עבור קווי תאי לוקמיה ותאי לוקמיה ראשוניים, 1 מ"ל של חיץ צביעה 10x מכיל 10 μL של 20 mM Hoechst 33342 ו- 50 μL של 1 mg/mL propidium iodide ב- PBS סטרילי (ריכוזים סופיים: Hoechst 33342 20 μM, PI 5 μg/mL).
- עבור PBMCs בריאים, 1 מ"ל של חיץ צביעה 10x מכיל 10 μL של 20 mM Hoechst 33342 ו 10 μL של 1 מ"ג / מ"ל יודיום ב PBS סטרילי (ריכוזים סופיים: Hoechst 33342 20 μM, PI 1 μg / mL).
הערה: הריכוז הסופי של פרופידיום יודיד צריך להיקבע לפני הניסויים. יש לבדוק תאים באמצעות טווח של ריכוזי PI (1, 2.5, 5 מיקרוגרם/מ"ל), ולאחר מכן יש להשוות את הכדאיות המחושבת על ידי Hoechst/PI לכדאיות הנמדדת באמצעות כחול טריפאן. ריכוזי ה-PI המפורטים לעיל נבחרו בהתבסס על כדאיות תאי המטרה בבארות בקרת מדיה (מעל ~90% עבור קווי תאי לוקמיה, מעל ~70% עבור PBMCs בריאים).
זהירות: Hoechst 33342 ו-propidium iodide הם חומרים מסרטנים פוטנציאליים. יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים בעת הטיפול בהם.
- לאחר הדגירה, השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להוסיף 10 μL של חיץ צביעה 10x לכל באר.
הערה: כדי למנוע זיהום צולב, ודא כי קצות פיפטה אינם נוגעים במדיה.
- טפחו בעדינות על הצלחת כדי לערבב ולנקות בועות. יש לכתם ב-37°C למשך 15 דקות.
- צנטריפוגו את הצלחת ב 200 גרם במשך 4 דקות כדי להביא את כל התאים לתחתית הצלחת. נגבו בזהירות את תחתית הצלחת במגבון לח כדי להסיר סיבים ו/או לכלוך שיפריעו להדמיה.
הערה 1: צנטריפוגה של הצלחת מבטיחה את הסיכויים הגבוהים ביותר לכל התאים להילכד בתמונה. לעתים קרובות תאים מתים יתנתקו ויצופו, ויספקו ערכים מטעים של ציטוטוקסיות. צנטריפוגה ממתנת השפעה זו.
הערה 2: הצלחת צריכה להיות מצולמת מהר ככל האפשר לאחר צנטריפוגה, באופן אידיאלי, בתוך 15 דקות. צנטריפוגה יכולה להפחית את הסלקטיביות של צביעת PI ועשויה לאפשר לתאים לצבור לאט יודיד פרופידיום. השיפור בדיוק שהושג על ידי הדמיה של התאים המתים עולה על העלייה הקלה בצביעת PI
