בדיקת המוליזה: שיטה חוץ גופית למדידת ליזה הנגרמת על ידי סידן יונופור באריתרוציטים אנושיים

תקציר

מקור: Bigdelou, P. et al., אינדוקציה של אריפטוזיס בכדוריות דם אדומות באמצעות יונופור סידן. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מתאר בדיקת מבחנה לקביעת המוליזה הנגרמת על ידי סידן-יונופור או ליזה של תאי דם אדומים בדגימה אנושית. הבדיקה מודדת את אחוז ההמוליזה על ידי כימות המוגלובין המשתחרר מאריתרוציטים קרועים.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. בידוד אריתרוציטים מדם שלם

1. הוסף 500 μL של דם מלא בחומצה ציטראט דקסטרוז (ACD) (מאוחסן ב 4 ° C) לצינור מיקרוצנטריפוגה.
   הערה: דם מלא נרכש ב- ACD. לדברי החברה, 1.5 מ"ל של ACD מתווסף 7 מ"ל של דם שלם (8.5 מ"ל נפח כולל).
2. צנטריפוגה את כל הדם ב 700 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ולהסיר את הפלזמה השקופה ואת מעיל באפי דק באמצעות פיפטה לעזוב את שכבת אריתרוציטים אדומה.
3. הכינו 1 ליטר של תמיסת רינגר המכילה 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 32 mM HEPES, 5 mM גלוקוז ו-1 mM CaCl₂. כוונן את ה- pH ל- 7.4 על ידי הוספת 2 טיפות μL של 1.0 M NaOH. כדי להכין תמיסת רינגר ללא סוכר, פעל לפי אותו פרוטוקול, אך אל תכלול גלוקוז בתמיסה.
4. לשטוף את אריתרוציטים 2x בתמיסת רינגר על ידי השעיית גלולת התא ב 1.5 מ"ל של תמיסת רינגר, צנטריפוגה ב 700 x גרם במשך 5 דקות ב RT, והסרת supernatant.
5. הפוך המטוקריט 0.4% על ידי השעיה מחדש של 40 μL של גלולת אריתרוציטים ב 9,960 μL של תמיסת רינגר ללא גלוקוז כדי להגיע לנפח סופי של 10 מ"ל
   הערה: המטוקריט הוא מונח המשמש להתייחסות לחלק הנפח של אריתרוציטים בהשעיה. המטוקריט 0.4% הוא השעיה המכילה 0.4% אריתרוציטים.
6. לדגור את תרחיף התא ב 37 ° C במשך 7 ימים.

2. טיפול באריתרוציטים עם יונומיצין ומדידת המוליזה

1. יש להמיס 1 מ"ג של מלח סידן יונומיצין ב-630 מיקרוליטר של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי להגיע לריכוז סופי של 2 מילימול. Aliquot ולאחסן ב -20 °C.
2. קח 1 מ"ל של המטוקריט 0.4% משלב 1.5 ולהוסיף 0.5 μL של 2 mM ionomycin כדי להגיע לריכוז סופי של 1 μM. לדגור במשך 2 שעות ב 37 ° C.
   1. השתמש 1 מ"ל של המטוקריט ללא טיפול ionomycin כמו שליטה שלילית.
3. צנטריפוגו את ההמטוקריטים שטופלו ביונומיצין ולא טופלו ב 700 x גרם במשך 5 דקות ב- RT והוציאו את הסופרנאטנטים שלהם כדי להשאיר את כדורי התא בתחתית הצינורות.
4. שטפו את התאים 3x בתמיסת רינגר על ידי השעיית כדורי התא ב-1.5 מ"ל של תמיסת רינגר, צנטריפוגה ב-700 x גרם למשך 5 דקות ב-RT, והשלכת הסופרנאטנטים.
5. כדי למדוד המוליזה, הוסף 1 מ"ל של המטוקריט 0.4% לא מטופל משלב 1.5 לצינור מיקרוצנטריפוגה ודגר במשך 2 שעות ב 37 ° C כבקרה שלילית עבור המוליזה (0%).
6. הוסף 1 מ"ל של המטוקריט 0.4% לא מטופל משלב 1.5 לצינור מיקרוצנטריפוגה וצנטריפוגה ב 700 x גרם במשך 5 דקות ב RT. להסיר את supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של מים מזוקקים לגלולה התא לדגור במשך 2 שעות ב 37 ° C כמו בקרה חיובית עבור המוליזה (100%).
7. הוסף 1 מ"ל של המטוקריט 0.4% שטופל ביונומיצין משלב 2.2 לצינור מיקרוצנטריפוגה.
8. צנטריפוגה את התאים הלא מטופלים, התאים המטופלים והתאים במים מזוקקים ב 700 x גרם במשך 5 דקות ב RT.
9. קחו 200 מיקרוליטר של הסופרנאטנטים והוסיפו לצלחת של 96 בארות.
10. מדוד את הספיגה ב- 541 ננומטר באמצעות קורא microplate.
11. חשב את ההמוליזה באמצעות משוואה 1:
    %המוליזה = (A_T - A₀)/(A₁₀₀ - A₀)*100
    כאשר A₀ הוא ספיגה של אריתרוציטים בתמיסת רינגר, A₁₀₀ הוא ספיגה של אריתרוציטים במים, ו- A_T הוא ספיגה של אריתרוציטים מטופלים על ידי יונומיצין.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת 96 באר	פישר סיינטיפיק	12-565-331
CaCl2	פישר סיינטיפיק	C79-500
צנטריפוגה	מיליפור סיגמא	M7157	דגם Eppendorf 5415C
DMSO	סיגמא-אולדריץ'	472301-100 מ"ל
גלוקוז מונוהידראט	סיגמא-אולדריץ'	Y0001745
HEPES Buffer (1 מטר)	פישר סיינטיפיק	50-751-7290	יש לאחסן ב-4°C
יונומיצין מלח סידן	EMD Milipore קורפ	407952-1 מ"ג	יש להתמוסס ב-DMSO כדי להגיע ל-2 מילימול. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C
KCl	פישר סיינטיפיק	עמ' 330-500
MgSO4	פישר סיינטיפיק	M65-500
צינור מיקרוצנטריפוגה	פישר סיינטיפיק	02-681-5
NaCl	פישר סיינטיפיק	S271-500
קורא מיקרו-צלחות HFM Synergy	ביוטק
דם מלא ב-ACD	זן-ביו		יש לאחסן ב-4°C ולחמם ל-37°C לפני השימוש