Annexin V Binding Assay: טכניקה מבוססת פלואורסצנטיות לזיהוי אריתרוציטים אפופטוטיים באמצעות תיוג פוספטידיל-סרין

Abstract

מקור: Bigdelou, P., et al. השראת אריפטוזיס בכדוריות דם אדומות באמצעות יונופור סידן. J. Vis. Exp. (2020)

בסרטון זה, אנו מדגימים את בדיקת הקישור של Annexin V כדי למדוד את מידת האריפטוזיס, מוות תאי מתוכנת של אריתרוציטים, באמצעות צביעת Annexin V פלואורסצנטית. אריתרוציטים אפופטוטיים מדגימים טרנסלוקציה של פוספטידיל-סרין מהעלון הפנימי לעלון החיצוני של קרום התא, מה שגורם ל-Annexin V המתויג כפלואורופור להיקשר לפוספטידיל-סרין המועבר, ובכך לפלוט אות פלואורסצנטי.

Protocol

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. מבחן מחייב נספח-V

1. יש להמיס 1 מ"ג של מלח סידן יונומיצין ב-630 מיקרוליטר של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי להגיע לריכוז סופי של 2 מילימול. Aliquot ולאחסן ב -20 °C.
2. קח 1 מ"ל של המטוקריט 0.4% ולהוסיף 0.5 μL של 2 mM ionomycin כדי להגיע לריכוז סופי של 1 μM. לדגור במשך 2 שעות ב 37 ° C.
3. צנטריפוגו את ההמטוקריטים שטופלו ביונומיצין ולא טופלו ב 700 x גרם במשך 5 דקות ב- RT, והוציאו את הסופרנאטנטים שלהם כדי להשאיר את כדורי התא בתחתית הצינורות.
4. שטפו את התאים 3x בתמי....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin V Alexa Fluor 488 - ערכת אפופטוזיס	פישר סיינטיפיק	A10788	יש לאחסן ב-4°C
ציטומטר זרימה BD FACSAria II	BD Biosciences	643177
יונומיצין מלח סידן	EMD Milipore קורפ	407952-1 מ"ג	יש להתמוסס ב-DMSO כדי להגיע ל-2 מילימול. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C
צנטריפוגה	מיליפור סיגמא	M7157	דגם Eppendorf 5415C
צינור ציטומטריה חד פעמי עגול לזרימה תחתונה	VWR	VWRU47729-566
CaCl2	פישר סיינטיפיק	C79-500
DPBS	VWR מדעי החיים	SH30028.02
צינור מיקרוצנטריפוגה	פישר סיינטיפיק	02-681-5
דם מלא ב-ACD	זן-ביו		יש לאחסן ב-4°C ולחמם ל-37°C לפני השימוש