Annexin V Binding Assay: טכניקה מבוססת פלואורסצנטיות לזיהוי אריתרוציטים אפופטוטיים באמצעות תיוג פוספטידיל-סרין

תקציר

מקור: Bigdelou, P., et al. השראת אריפטוזיס בכדוריות דם אדומות באמצעות יונופור סידן. J. Vis. Exp. (2020)

בסרטון זה, אנו מדגימים את בדיקת הקישור של Annexin V כדי למדוד את מידת האריפטוזיס, מוות תאי מתוכנת של אריתרוציטים, באמצעות צביעת Annexin V פלואורסצנטית. אריתרוציטים אפופטוטיים מדגימים טרנסלוקציה של פוספטידיל-סרין מהעלון הפנימי לעלון החיצוני של קרום התא, מה שגורם ל-Annexin V המתויג כפלואורופור להיקשר לפוספטידיל-סרין המועבר, ובכך לפלוט אות פלואורסצנטי.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. מבחן מחייב נספח-V

1. יש להמיס 1 מ"ג של מלח סידן יונומיצין ב-630 מיקרוליטר של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי להגיע לריכוז סופי של 2 מילימול. Aliquot ולאחסן ב -20 °C.
2. קח 1 מ"ל של המטוקריט 0.4% ולהוסיף 0.5 μL של 2 mM ionomycin כדי להגיע לריכוז סופי של 1 μM. לדגור במשך 2 שעות ב 37 ° C.
3. צנטריפוגו את ההמטוקריטים שטופלו ביונומיצין ולא טופלו ב 700 x גרם במשך 5 דקות ב- RT, והוציאו את הסופרנאטנטים שלהם כדי להשאיר את כדורי התא בתחתית הצינורות.
4. שטפו את התאים 3x בתמיסת רינגר על ידי השעיית כדורי התא ב-1.5 מ"ל של תמיסת רינגר, צנטריפוגה ב-700 x גרם למשך 5 דקות ב-RT, והשלכת הסופרנאטנטים.
5. להשעות מחדש את כדורי תאי אריתרוציטים שטופלו ביונומיצין ולא טופלו ב -1 מ"ל של חיץ מחייב 1x.
6. יש לדלל 2 מ"ל של מאגר הקישור 5x annexin V ב-8 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) כדי לקבל חיץ קשירה 1x.
7. קח 235 μL של מתלי התא במאגר הקשירה והוסף 15 μL של Annexin V-Alexa קמח 488 מצומד.
8. דגרו על התאים בטמפרטורת החדר (RT) למשך 20 דקות במקום חשוך. צנטריפוגה ב 700 x גרם במשך 5 דקות ב RT ולהסיר את supernatant.
9. שטפו את התאים 2x עם 1x חוצץ קשירה, על ידי השעיית גלולת התא ב 1.5 מ"ל של מאגר הקשירה, צנטריפוגה ב 700 x גרם במשך 5 דקות ב RT, והסרת supernatant.
10. השהה מחדש את כדורי התא ב- 250 μL של חיץ קישור 1x למדידות ציטומטריית זרימה.

2. ציטומטריית זרימה

1. העבר 200 μL של אריתרוציטים מוכתמים V נספח 1 מ"ל צינורות פוליסטירן תחתון עגול תואם ציטומטריית זרימה.
2. התחברו לתוכנת ציטומטריית הזרימה ולחצו על כפתור הניסוי החדש. לחץ על כפתור הצינור החדש. בחר את הגיליון הגלובלי ובחר את ניתוח היישום כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות עם אורך גל עירור של 488 ננומטר ואורך גל פליטה של 530 ננומטר.
3. הגדר את מספר התאים ל- 20,000 שייאספו לצורך ניתוח מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS).
4. בחר את הצינור הרצוי ולחץ על כפתור ההעמסה. לחץ על כפתור ההקלטה למדידות פיזור קדימה ופיזור צדדי. חזור על הפעולה עבור כל הדגימות.
5. לחץ לחיצה ימנית על כפתור הדגימה ולחץ על החל ניתוח אצווה כדי ליצור את קובץ התוצאה.
6. לחץ לחיצה ימנית על כפתור הדגימה ולחץ על יצירת קבצי FSC.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Annexin V Alexa Fluor 488 - ערכת אפופטוזיס	פישר סיינטיפיק	A10788	יש לאחסן ב-4°C
ציטומטר זרימה BD FACSAria II	BD Biosciences	643177
יונומיצין מלח סידן	EMD Milipore קורפ	407952-1 מ"ג	יש להתמוסס ב-DMSO כדי להגיע ל-2 מילימול. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C
צנטריפוגה	מיליפור סיגמא	M7157	דגם Eppendorf 5415C
צינור ציטומטריה חד פעמי עגול לזרימה תחתונה	VWR	VWRU47729-566
CaCl2	פישר סיינטיפיק	C79-500
DPBS	VWR מדעי החיים	SH30028.02
צינור מיקרוצנטריפוגה	פישר סיינטיפיק	02-681-5
דם מלא ב-ACD	זן-ביו		יש לאחסן ב-4°C ולחמם ל-37°C לפני השימוש