$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
NOTE: כנקודת התייחסות נוחה לקוראים, המתודולוגיה הבאה מתארת את תנאי התרבית והחומרים הספציפיים הדרושים למדידת הזמינות הביולוגית של Fe מ-20 דגימות ניסיוניות, בתוספת בקרות האיכות הנדרשות, בריצה של הביו-אסי. הגדלת מספר הדגימות מעבר לקיבולת זו אינה מומלצת בשל הזמן הנדרש לתרביות תאים שונות ולשלבי עיכול חוץ גופי בתוך הביואסיה.
1. בחירת כמות הדגימות
- עבור מזון מוצק או נוזלי, לקבוע כמות של מזון שיכול להיחשב מייצג של המדגם להיבדק.
- בבדיקת זמינות ביולוגית של Fe ממגוון שעועית, השתמשו ב-100-150 גרם של זרעי שעועית ועבדו כמות זו לדגימה הומוגנית.
- עבור דגימות נוזלים כגון מיצים מועשרים, מוצרי חלב ומשקאות ספורט, ודא כי המזון מעורבב היטב לפני הדגימה.
הערה: כמות חומר זרעי השעועית שהוזכרה לעיל חיונית כדי להסביר את ההבדלים המובנים בין זרעים של יבול בסיסי זה.
2. הכנת דגימות
- יש לשטוף את הלכלוך והאבק מכל דגימת מזון במים מזוקקים שעברו דה-יוניזציה לפני העיבוד.
- לעבד את כמות הדגימה המתאימה בהתאם למטרות הניסוי, כגון על ידי שיטת בישול וטחינה.
הערה: לצורך בישול ועיבוד, חיוני להשתמש בכלי בישול ובציוד שאינם מהווים מקור פוטנציאלי לזיהום Fe. ציוד נירוסטה אינו מזהם; עם זאת, ציוד כגון מטחנות אבן, כלי בישול מברזל יצוק וכל ציוד שאינו נירוסטה המכיל Fe יכול להוסיף כמויות משמעותיות של Fe מזהם. מטחנת קפה סטנדרטית מנירוסטה מתאימה לעתים קרובות לטחינה.
- Lyophilize ולטחון לאבקה הומוגנית.
הערה: לאחר הומוגניזציה, מחקרים הראו כי שלושה שכפולים עצמאיים של ניתוח מספיקים עבור כל מזון נמדד.
- אם הומוגניות מדגם קשה להשיג, לשנות את ניסוח או עיבוד של המוצר. אם זה לא אפשרי, להוסיף שכפולים אם אי הומוגניות אינה חמורה.
- עבור רוב המזון המוצק הומוגני, להשתמש 0.5 גרם של מדגם lyophilized לכל לשכפל. במידת הצורך, השתמש בעד 1.0 גרם דגימה לכל שכפול, אך בדוק אם יותר מ- 0.5 גרם מניב תועלת במידת התגובה.
הערה: כמויות גבוהות מ-0.5 גרם מזון מוצק עלולות לסתום את קרום הדיאליזה (ראה להלן).
- השתמש 1-2 מ"ל של דגימות נוזליות.
הערה: ליופיליזציה היא לעתים קרובות לא הכרחי עבור דגימות נוזליות.
3. תרבית תאים Caco-2
- תרביות מניות
- לרכוש תאי Caco-2 מספק מוסמך.
- תרבית את התאים מבקבוקוני מלאי בטמפרטורה של 37°C באינקובטור עם 5% CO2 אטמוספירת אוויר (לחות קבועה) באמצעות מדיום הנשר המעובד (DMEM) של Dulbecco בתוספת HEPES של 25 mM (pH 7.2), 10% (v/v) נסיוב בקר עוברי (FBS), ותמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית 1%.
- ברגע שיש מספיק תאים זמינים, בדרך כלל לאחר 7-10 ימים של תרבית, זרעו את התאים בצלוחיות שאינן מצופות קולגן בצפיפות של 30,000 תאים לסמ"ק2.
- בחר את גודל הבקבוק בהתאם למספר התאים הזמינים הדרושים לזריעת צלחות מרובות.
הערה: באופן כללי, צלוחיות T225 (225 ס"מ2) פועלות בצורה הטובה ביותר לניסויים שבהם נעשה שימוש ב-11 צלחות מרובות באר (6-באר; 9.66 ס"מ2/באר) (10 צלחות להשוואות דגימה, צלחת אחת לבקרות איכות) לכל ביואסי.
- לגדל תאים בצלוחיות במשך 7 ימים, לשנות את המדיום כל יומיים, ולהשתמש ביום השביעי לזריעת לוחות multiwell.
הערה: מומלץ להשתמש בטווח מעברים של לא יותר מ 10-15 קטעים מהרגע שבו התאים מתחילים מתרבית מלאי ולאחר מכן משמשים בסדרה של ניסויים. מעברי תרביות תאים צריכים להיות מוגבלים מכיוון שטווח רחב של מעברים יכול לגרום לשינויים אדפטיביים בקו התא, ולכן לשונות בתגובת המודל.
- תרבית תאים על צלחות מרובות בארות
- זרעו את תאי Caco-2 בצפיפות של 50,000 תאים לסמ"ק2 בצלחות מצופות קולגן 6 בארות.
הערה: שלב זה בדרך כלל עובד בצורה הטובה ביותר אם נעשה ביום רביעי. השלבים הבאים יבהירו מדוע יום זה בשבוע הוא אופטימלי.
- לגדל את התאים במשך 12 ימים ב 37 ° C באינקובטור עם 5% CO2 אטמוספירה אוויר (לחות קבועה) באמצעות DMEM בתוספת 25 mM HEPES (pH 7.2), 10% (v/v) FBS, ו 1% פתרון אנטיביוטי-אנטימיקוטית.
הערה: גידול שכבות התא במשך יותר מ-12 יום עלול לגרום לצמיחת יתר של תאים. מחקרים קודמים הראו בבירור כי בתנאים אלה, לאחר 12 יום לאחר הזריעה, חד-שכבת התא בוגרת, מחוברת היטב לצלחת, ואופטימלית בעקביות התגובה. גידול התאים זמן רב יותר, כגון עד 19-21 ימים, גורם לצמיחת יתר של תאים, והמדיה מתרוקנת במהירות בחומרים מזינים, וכתוצאה מכך חד-שכבות לא בריאות.
- במהלך תקופה של 12 ימים, שנה את המדיום לפחות כל יומיים בלוח זמנים יומי עקבי.
- ביוםה-12 לאחר הזריעה, החלף את מדיום התרבית ב-2 מ"ל של מדיום חיוני מינימלי (MEM [pH 7]) בתוספת צינורות 10 mM (piperazine-N,N'-bis-[2-ethanesulfonic acid]), 1% תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית, הידרוקורטיזון (4 מ"ג/ליטר), אינסולין (5 מ"ג/ל'), סלניום (5 מק"ג/ל'), טריודותירונין (34 מק"ג/ל') וגורם גדילה אפידרמלי (20 מק"ג/ל').
הערה: אם הזריעה החלה ביום רביעי, אז היום ה-12 יהיה יום שני.
- למחרת (כלומר, יום 13), הסר את ה- MEM והחלף אותו ב- 1 מ"ל של MEM (pH 7).
הערה: שלב זה יתרחש ביום שלישי. זהו היום שבו מתחילה הבדיקה הביולוגית; לפיכך, לוח הזמנים בן 13 הימים מניב את היתרון של לוח זמנים שבועי עקבי, המאפשר לבצע את הבדיקה הביולוגית באופן עקבי באותו יום חול.
4. עיכול חוץ גופי
- הכנת טבעות החדרה
- צרו טבעת הזרקה מעוקרת באמצעות טבעת O מסיליקון המצוידת בקרום דיאליזה שטוף חומצה (איור 1A).
הערה: הכינו את התוספות יום אחד מראש (כלומר, יום שני, יום 12) של יום הבדיקה הביולוגית ואחסנו במים של 18 MΩ בטמפרטורה של 4°C עד שהן מוכנות לשימוש.
- ביום הבדיקה הביולוגית (יום שלישי, יום 13), הוציאו את התוספות מהמקרר, סננו והחליפו את המים ב-0.5 M HCl. השאירו אותם בטמפרטורת החדר במכסה מנוע של זרימה למינרית למשך שעה לפחות 1 לפני השימוש.
הערה: שלב זה צריך להיעשות לפני הסרת MEM מלוחות התרבית. שטיפת חומצה של הממברנה משמשת להסרת Fe מזהמת אפשרית ומחטא את טבעת הכנס ואת הממברנה.
- יש לנקז את ה-0.5 M HCl מהתוספות ולשטוף במים סטריליים של 18 MΩ. יש לאחסן במים סטריליים של 18 MΩ בטמפרטורת החדר במכסה מנוע בזרימה למינרית עד שהם מוכנים לשימוש.
- הכנס טבעת לכל באר של לוחות 6 באר עם תאי Caco-2, ובכך ליצור מערכת שני תאים. החזרת הצלחות עם התוספות לאינקובטור.
הערה: שלב זה צריך להיעשות מיד לאחר הוספת 1.0 מ"ל MEM טרי לכל באר (ראה שלב 3.2.5).
- הכנת תמיסת פפסין
- ביום הניסוי, הכינו את תמיסת הפסין על ידי המסת 0.145 גרם פפסין ב-50 מ"ל של 0.1 M HCl. נערו את התמיסה בעדינות על שייקר פלטפורמה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- הכנת תמיסת לבלב-מרה
- באותו יום של הניסוי, להכין 0.1 M NaHCO3 על ידי המסת 2.1 גרם של NaHCO3 ב 250 מ"ל של 18 MΩ מים.
- מערבבים 0.35 גרם של פנקראטין ו 2.1 גרם של תמצית מרה ב 175 מ"ל של 0.1 M NaHCO3.
- לאחר מסיסים בלבלב ובתמצית המרה, הוסיפו 87.5 גר' של שרף החלפת קטיונים חלש (ראו טבלת חומרים) וערבבו על ידי ניעור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- יוצקים את הבוצה לתוך עמוד גדול ואוספים את הפולט.
- הצביעו על העמוד עם 70 מ"ל נוספים של 0.1 M NaHCO3, ואספו נפח זה לתמיסת מרה של הלבלב.
הערה: מטרת השרף היא להסיר את המזהם Fe הנפוץ בתמציות הלבלב-מרה.
- ליזום עיכול חוץ גופי.
- שקלו את הדגימה בצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מ"ל (פוליפרופילן), ולאחר מכן הוסיפו 10 מ"ל מלח פיזיולוגי ב-pH 2, המכיל 140 mM NaCl ו-5 mM KCl.
- התחל את תהליך עיכול הקיבה על ידי הוספת 0.5 מ"ל של תמיסת פפסין חזירית מוכנה לדגימה ודגור על שייקר נדנדה בסביבה נמוכה ועדינה למשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.
- לאחר תקופה זו, להתחיל את תהליך העיכול במעיים של כל דגימה על ידי התאמת ה- pH ל 5.5-6.0 עם 1.0 M NaHCO3.
- הוסף 2.5 מ"ל של תמיסת מרה הלבלב לכל צינור דגימה והתאם את ה- pH ל- 6.9-7.0 עם 1.0 M NaHCO3.
- לאחר התאמת ה- pH, השווה את הנפח בכל צינור באמצעות תמיסת 140 mM NaCl, 5 mM KCl (pH 6.7), מדידת משקל הצינור עם ערך יעד של 15 g.
הערה: עבור מזונות מסוימים, ייתכן שיהיה צורך להביא את הנפח הכולל ל 16 גרם או 17 גרם, בהתאם ליכולת האגירה של המזונות.
- העבירו 1.5 מ"ל מכל עיכול מעיים לתוך החדר העליון (כלומר, מכיל את טבעת ההחדרה עם קרום הדיאליזה) של באר מקבילה של צלחת תרבית 6 בארות המכילה את תאי Caco-2 (איור 1B).
- יש להחליף את מכסה הצלחת ולדגור בטמפרטורה של 37°C (5% CO2 אוויר) על שייקר נדנדה ב-6 תנודות לדקה למשך שעתיים.
- הסר את טבעת ההוספה עם התקציר והוסף 1 מ"ל נוספים של MEM (pH 7) לכל באר.
- החזירו את צלחת תרבית התאים לאינקובטור (37°C; 5% CO2 אוויר) למשך 22 שעות נוספות.
- לאחר 22 שעות, להסיר את המדיום תרבית התא ולהוסיף 2.0 מ"ל של 18 MΩ מים monolayer.
הערה: המים יעשו ליזה אוסמוטית לתאים.
- קצרו את כל הליזט של התא לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות פוליפרופילן סטנדרטיים או דומים לאנליזות הבאות של חלבון התא ופריטין התא.
