$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
הערה: כל ההליכים חייבים להיעשות בארון בטיחות ביולוגית Class II עם המפוח דולק והאורות כבויים.
1. הכנת חומרים
הערה: כל החומרים מפורטים בטבלת החומרים.
- הכן מדיום 1, צנטריפוגה בינונית 2, ופתרונות אחסון ועבודה של פלואורסצנטי 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose (2-NBDG או FD-glucose) על פי טבלה 1 בארון בטיחות ביולוגית Class II. הגן על גלוקוז FD מפני אור לאורך כל הניסוי על ידי כיבוי כל האורות מתחת למכסה המנוע.
- השתמשו בריאגנטים מוכנים לשימוש של תרביות תאים: טריפסין-EDTA, מלח חוצץ פוספט (PBS), ומדיום הנשר המעובד של Dulbecco ללא גלוקוז וללא פנול אדום (להלן, DMEM ללא גלוקוז).
- השתמש 20 מ"ל של בדיקת משקעים רדיואימונוגרפיים (RIPA) lysis buffer.
הערה: בסעיפים הבאים, דלדול חוץ-תאי וספיגה תוך-תאית של מינונים שונים של גלוקוז FD מושווים בפיברובלסטים 3T3-L1 עם וללא גירוי אינסולין (איור 1).
2. תרבית תאים 3T3-L1 ותחזוקה
- תרבית 3T3-L1 פיברובלסטים עכבר על ידי ציפוי 1 x 106 תאים מדוללים ב 20 מ"ל של בינוני 1 בשני לוחות 96 באר. צלחת 100 μL של תרחיף התא לכל באר, הבטחת שמירה על הומוגניות של השעיה זו על ידי ערבוב. לגדל תאים במשך 48 שעות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס (5% CO2 ו-95% לחות) מבלי לשנות מדיה עד למפגש של 70%-80%.
- לשמור על תאים זורמים וצום על ידי תרבית אותם באותו מדיום במשך 48 שעות. לשנות את זמן הדגירה מ 24-72 שעות בהתאם למצב הקטבולי הרצוי בצום.
3. הרעבה של תאי 3T3-L1
- דקנט מדיה מתאים בלוחות 96 בארות. יש לספוג את יתרת הנוזלים באמצעות מגבות נייר סטריליות.
- שטפו את צלחת 96 הבארות עם 100 מיקרוליטר PBS לכל באר וספגו את הנוזלים הנותרים במגבות נייר סטריליות.
- הוסף 100 μL של DMEM ללא גלוקוז לכל באר ודגר במשך 40 דקות. התאם את זמן הדגירה בהתאם לסוג התא, הגירויים ורמת הצום הרצויה.
הערה: זמן הדגירה עשוי לדרוש אופטימיזציה בהתאם לעונה.
4. הכנת תמיסות גלוקוז FD בריכוזים שונים
הערה: הניסוי באיור 1 בוחן מדיה חוץ-תאית ובין-תאית עם וללא גירוי באמצעות אינסולין.
- השתמש בשמונה עותקים משוכפלים (שורה אחת בלוח של 96 בארות) עבור כל תנאי גירוי. לכן, הכינו 1 מ"ל לכל תנאי גירוי (המפורט בטבלה 2 ולהלן).
- השתמש בשמונה מצבי גירוי ללא אינסולין: FD-גלוקוז של 2.5 מיקרוגרם/מ"ל, 1 מיקרוגרם/מ"ל, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל, 0.2 מיקרוגרם/מ"ל, 0.1 מיקרוגרם/מ"ל, 0.05 מיקרוגרם/מ"ל ו-0 מיקרוגרם/מ"ל (בקרה ללא FD-גלוקוז) בצלחת אחת בת 96 בארות.
- השתמש בשמונה מצבי גירוי עם אינסולין (10 מיקרוגרם / מ"ל, ריכוז סופי): גלוקוז FD של 2.5 מיקרוגרם / מ"ל, 1 מיקרוגרם / מ"ל, 0.5 מיקרוגרם / מ"ל, 0.2 מיקרוגרם / מ"ל, 0.1 מיקרוגרם / מ"ל, 0.05 מיקרוגרם / מ"ל ו 0 מיקרוגרם / מ"ל (בקרה ללא גלוקוז FD) בצלחת נוספת של 96 בארות.
- כדי להכין תנאי גירוי, דלל 1 μL של 5 מ"ג / מ"ל תמיסת עבודה FD-גלוקוז (טבלה 1) ב 999 μL של DMEM ללא גלוקוז כדי לקבל 1 מ"ל של תמיסת מלאי עבודה (דילול 1:1000 או 5 מיקרוגרם / מ"ל).
- באמצעות פתרון מלאי עבודה זה, הכינו דילולים של 1:2000, 1:5000, 1:10,000, 1:25,000, 1:50,000 ו-1:100,000 של FD-glucose כדי לקבל 2.5 מיקרוגרם/מ"ל, 1 מיקרוגרם/מ"ל, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל, 0.2 מיקרוגרם/מ"ל, 0.1 מיקרוגרם/מ"ל ו-0.05 מיקרוגרם/מ"ל (טבלה 2) בצינורות של 2 מ"ל מיד לפני ניסויים בארון בטיחות ביולוגית ללא אורות.
- חזור על שלב 4.4 והוסף 1 מיקרוליטר אינסולין (10 מ"ג / מ"ל, ריכוז סופי) לכל אחד מהתנאים שצוינו לעיל.
הערה: הריכוז הסופי של אינסולין בדגימות אלה הוא 10 מיקרוגרם / מ"ל = 1.7 nmol / מ"ל. כדי להשיג הומוגניזציה, הוסף אינסולין לצינורות לפני הוספת פתרונות אחרים.
5. טיפול בתאי 3T3-L1 מורעבים
- לאחר 40 דקות של דגירה, decant את DMEM ללא גלוקוז מכל באר בצלחות 96 באר לספוג את הנוזל הנותר עם מגבות נייר סטריליות.
- הוסף 100 μL (לכל באר) כל אחד מתנאי הטיפול השונים שתוארו לעיל לבארות לאורך עמוד אחד, ו- 100 μL (לכל באר) מאותו תנאי טיפול לבארות לאורך השורה (שמונה העתקים) בשתי הצלחות בנות 96 הקידוחים. תייגו את הצלחות שניצלו את התנאים עם וללא אינסולין. הוסף DMEM ללא גלוקוז בלבד לבארות הבקרה (n = 8).
- דוגרים על הצלחת במשך 40 דקות באינקובטור תרבית תאים (37°C, 5% CO2 ו-95% לחות) בחושך.
6. מדידות חוץ-תאיות ובין-תאיות עבור תאי 3T3-L1 מגורים
- לאחר שהתאים עברו גירוי במשך 40 דקות, העבירו את אמצעי הגירוי משני הלוחות ללוחות חדשים בני 96 בארות השומרים על אותה פריסה ניסיונית.
- דק כל פתרון שנותר מן המקורי מגורה 96 צלחות באר עם תאים על מגבות נייר סטריליות.
- לחלופין, שטפו תאים עם PBS. יש להסיר PBS ולרוקן כל תמיסה שנותרה על מגבות נייר סטריליות.
- הוסף 100 μL של חיץ RIPA lysis לכל באר. לחלופין, הוסף מעכב פרוטאז למאגר RIPA כדי להגן על חלבונים. מניחים צלחות המכילות RIPA בשייקר למשך 30 דקות.
- באמצעות קורא מיקרו-צלחות (Table of Materials), מודדים פלואורסצנטיות באורכי גל של עירור (Ex) ופליטה (Em) של 485 ו-535 ננומטר, בהתאמה, תחילה בתווך המכיל גלוקוז FD חוץ-תאי, ולאחר מכן, בלוח עם תאים ב-RIPA-lysed בתום דגירה של 30 דקות (ראה שלב 6.4).
טבלה 1: הכנת מדיה תרבותית ותמיסות גלוקוז FD.
| פתרון/בינוני | רכיבים |
| אתנול:DMSO (1:1/v/v) | אתנול (200 μL) ו- DMSO (200 μL) בצינור 1-1.5 מ"ל; השתמש אתנול כיתה תרבית תאים DMSO |
| בינוני 1 | DMEM (89 מ"ל), פניצילין/סטרפטומיצין (1%) (1 מ"ל) וסרום עגל (10%) (10 מ"ל) בצינור סטרילי של 50 מ"ל |
| אמצעי צנטריפוגה 2 | DMEM (89 מ"ל), פניצילין/סטרפטומיצין (1%) (1 מ"ל) וסרום בקר (10%) (10 מ"ל) בצינור סטרילי של 50 מ"ל |
| אחסון תמיסת גלוקוז FD 5 מ"ג / מ"ל (14.5 mM) | גלוקוז FD (1 מ"ג) ואתנול:DMSO (1:1/v/v) (200 μL) בצינור 0.5 מ"ל; יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C, רצוי תחת ארגון או אטמוספירת חנקן |
| תמיסת FD-גלוקוז עובדת 5 מיקרוגרם/מ"ל (14.5 מילימול) | אחסון תמיסת גלוקוז FD 5 מ"ג / מ"ל (1 μL), DMEM ללא גלוקוז (999 μL); להכין מיד לפני הניסוי. |
טבלה 2: הכנת תמיסות FD-גלוקוז בריכוזים שונים לניסויים המוצגים באיור 1.
| דילול | לשלוט | 1:2x103 | 1:5x103 | 1:1x104 | 1:2.5x104 | 1:5x104 | 1:1x105 |
| ריכוז (מק"ג/מ"ל) | 0 | 2.5 | 1 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 0.05 |
| DMEM ללא גלוקוז (μL) | 1000 | 500 | 800 | 900 | 960 | 980 | 990 |
| FD גלוקוז 5 מיקרוגרם/מ"ל (μL) | 0 | 500 | 200 | 100 | 40 | 20 | 10 |
