מדידת דלדול אנלוגי של גלוקוז פלואורסצנטי חוץ-תאי: טכניקת מדידה חלופית להערכת ספיגת גלוקוז באיברי עכבר Ex Vivo

תקציר

מקור: Kumar, S. B. et al., דלדול גלוקוז חוץ-תאי כמדד עקיף לספיגת גלוקוז בתאים וברקמות ex vivo.J. Vis. Exp.(2022)

בסרטון זה, אנו מדגימים טכניקת ex vivo למדידת דלדול אנלוגי של גלוקוז חוץ-תאי באיברי עכבר שנקצרו. זה כרוך לדגור על רקמת העכבר בתמיסה המכילה deoxyglucose מסומן פלואורסצנטי, אשר נלקח על ידי התאים. ספיגת הגלוקוז האנלוגית יכולה להיקבע בעקיפין על ידי מדידת הפלואורסצנטיות של המדיום המודגר.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

הערה: כל ההליכים חייבים להיעשות בארון בטיחות ביולוגית Class II עם המפוח דולק והאורות כבויים.

1. הכנת חומרים

הערה: כל החומרים מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכן מדיום 1, צנטריפוגה בינונית 2, ופתרונות אחסון ועבודה של פלואורסצנטי 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose (2-NBDG או FD-glucose) על פי טבלה 1 בארון בטיחות ביולוגית Class II. הגן על גלוקוז FD מפני אור לאורך כל הניסוי על ידי כיבוי כל האורות מתחת למכסה המנוע.
2. השתמשו בריאגנטים מוכנים לשימוש של תרביות תאים: טריפסין-EDTA, מלח חוצץ פוספט (PBS), ומדיום הנשר המעובד של Dulbecco ללא גלוקוז וללא פנול אדום (להלן, DMEM ללא גלוקוז).

2. מדידת Ex vivo של דלדול גלוקוז FD חוץ-תאי באיברים

1. לטפל בעכברים עם תרכובות הממריצות את חילוף החומרים של גלוקוז לפני נתיחת האיברים, כדלקמן.
2. השתמש בעכברי Lep^ob זכרים בני תשעה שבועות (n = 11). האכילו את כל העכברים בתזונת צ'או קבועה לפני הניסוי.
3. הקצו עכברים באופן אקראי לשלוש קבוצות עבור זריקות intraperitoneal (i.p.).
   1. הזריקו עכברים מקבוצת הביקורת Lep^ob עם 0.1 מ"ל של PBS סטרילי (n = 4).
   2. הזריקו עכברים מקבוצת האינסולין Lep^ob עם 0.1 מ"ל PBS סטרילי, המכיל 12 IU אינסולין אנושי לכל גרם של משקל גוף (BW) (n = 3).
   3. הזריקו עכברים מקבוצת AAC2 Lep^ob עם 0.1 מ"ל PBS סטרילי, המכיל 0.1 nmol AAC2 לגרם משקל גוף (BW) (n = 4).
4. לאחר 15 דקות, יש לשאוף עכברים לשאיפה של 5% איזופלורן ולהוציא דם על ידי ניקוב לב מבעלי החיים המורדמים.
5. יש לנתח רקמת שומן לבן אפידידימלי ויסצרלי (200 מ"ג), כבד (200 מ"ג) ומוח שלם מכל חיה. השתמש במכסה מנוע בטיחות ביולוגית Class II לטיפול ברקמות.
6. הכן פתרון עבודה FD-גלוקוז (0.29 mM) ב- DMEM ללא גלוקוז בארון בטיחות ביולוגית Class II ללא אור.
7. מדוד את הפלואורסצנטיות של תמיסת עבודה FD-גלוקוז (0.29 מילימול) באורכי גל עירור ופליטה של 485 ו- 535 ננומטר, בהתאמה, באמצעות קורא מיקרו-לוחות.
8. דגרו על הרקמות/איברים שנקטפו בצלחת בת 6 בארות המכילה PBS למשך דקה אחת. טפלו בכל רקמה או איבר בבאר נפרדת.
9. לאחר דקה, הניחו כל טישו על מגבת נייר סטרילית כדי לספוג PBS. מעבירים רקמות/איברים לצלחת נפרדת בת 6 בארות המכילה 4,000 מיקרוליטר DMEM נטול גלוקוז ודגרים למשך 2 דקות.
10. לאחר 2 דקות, להסיר ולהעביר את הרקמות לתוך בארות של צלחת 6 בארות המכילה 0.29 mM FD גלוקוז פתרון עבודה (1 מ"ל / באר). לדגור על צלחות 6 בארות המכילות רקמות בתמיסת עבודה FD-גלוקוז ב 37 ° C (5% CO₂ ו 95% לחות).
11. אספו 100 מיקרוליטר של תמיסת עבודה של גלוקוז FD מכל באר לאחר 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ו-120 דקות של דגירה, כדי לנתח את הקינטיקה של דלדול גלוקוז FD חוץ-תאי. יש לנער לפני ואחרי האיסוף.
12. העבר 100 μL של תמיסת עבודה FD-גלוקוז ללוחות 96 בארות כדי למדוד את הפלואורסצנטיות באורכי גל עירור ופליטה של 485 ו- 535 ננומטר, בהתאמה, באמצעות קורא מיקרו-לוחות.
13. נרמלו פלואורסצנטיות לערך של 0 דקות (100%) עבור כל איבר בכל חיה (איור 1).

טבלה 1: הכנת מדיה תרבותית ותמיסות גלוקוז FD.

פתרון/בינוני	רכיבים
אתנול:DMSO (1:1/v/v)	אתנול (200 μL) ו- DMSO (200 μL) בצינור 1-1.5 מ"ל; השתמש אתנול כיתה תרבית תאים DMSO
בינוני 1	DMEM (89 מ"ל), פניצילין/סטרפטומיצין (1%) (1 מ"ל) וסרום עגל (10%) (10 מ"ל) בצינור סטרילי של 50 מ"ל
אמצעי צנטריפוגה 2	DMEM (89 מ"ל), פניצילין/סטרפטומיצין (1%) (1 מ"ל) וסרום בקר (10%) (10 מ"ל) בצינור סטרילי של 50 מ"ל
אחסון תמיסת גלוקוז FD 5 מ"ג / מ"ל (14.5 mM)	גלוקוז FD (1 מ"ג) ואתנול:DMSO (1:1/v/v) (200 μL) בצינור 0.5 מ"ל; יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C, רצוי תחת ארגון או אטמוספירת חנקן
תמיסת FD-גלוקוז עובדת 5 מיקרוגרם/מ"ל (14.5 מילימול)	אחסון תמיסת גלוקוז FD 5 מ"ג / מ"ל (1 μL), DMEM ללא גלוקוז (999 μL); להכין מיד לפני הניסוי.

תוצאות

איור 1: קינטיקה של דלדול חוץ-תאי של גלוקוז FD באיברים שונים ex vivo. (A-C) עכברי Lep^ob הוזרקו עם רכב (PBS, n = 4), אינסולין (12 IU/kg BW, n = 3) ו- AAC2 (1 nmol/g BW, n = 3). לאחר 15 דקות, רקמות נותחו ובודדו. חצילים של (A) שומן בטני, (B) כבד ו-(C) מוח הודגרו ב-FD-גלוקוז (0.29 מילימול). הקינטיקה של דלדול ג...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחות 96 בארות	בז	353227	כלי פלסטיק
ב6. עכברים זכרים V-Lepob/J	מעבדת ג'קסון	מספר מניה 000632	עכברים
BioTek Synergy H1 קורא מיקרו-צלחות מודולרי רב-מצבי (Fisher Scientific, ארה"ב)	Fisher Scientific, ארה"ב	Fisher Scientific, ארה"ב	מכשיר
אינקובטור תאים	פורמה	מעיל מים סדרה II	מכשיר
דיאטה (דיאטת עכברים/חולדות, מוקרן)	אנוויגו	Teklad LM-485	דיאטה
איזופלורן, 5%	הנרי שיין	NDC 11695-6776-2	מרדים
תמיסת אגירה פוספט	סיגמא-אולדריץ'	DA537-500 מ"ל	תרבית תאים
פניצילין/סטרפטומיצין (P/S)	Gibco/ThermoFisher	15140-122	תרבית תאים
DMEM ללא גלוקוז ופנול אדום	Gibco/ThermoFisher	A14430-01	תרבית תאים
פלואורסצנטי 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3- benzoxadiazol-4-yl) amino]-Dglucose)	סיגמא	72,987-1 מ"ג	בדיקת מעבדה
מדיום הנשר המותאם של דולבקו	Gibco/ThermoFisher	11965-092	תרבית תאים
סרום בקר	Gibco/ThermoFisher	161790-060	תרבית תאים
אתנול	סיגמא-אולדריץ'	E7023-500 מ"ל	מגיב