מדידת התכווצות SMC במבחנה: שיטה לא פולשנית להערכת התכווצות תאי שריר חלק באמצעות חישת עכבת מצע תא חשמלי

תקציר

מקור: Bogunovic, N. et al., בידוד של תאי שריר חלק אבי העורקים הראשוני הספציפי למטופל ומדידות התכווצות בזמן אמת כמותיות למחצה במבחנה. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון וידאו זה מתאר את מדידת התכווצות תאי השריר החלק באבי העורקים (SMC) באמצעות חישת עכבה חשמלית של מצע התא, או ECIS. ECIS מודד את תנועת התאים והיא שיטה אמינה למדידת התכווצויות.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית

1. מדידת התכווצות (לדוגמה SMC)

1. הכינו מערך ECIS 96w10e (ראו איור 1A לתמונה מייצגת של המערך עם אלקטרודות מוגדלות ותאים שנזרעו על האלקטרודות).
   הערה: בצע את השלבים הבאים מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית של תרבית רקמה סטרילית.
   1. מצפים מערך סטרילי של 96w10e ב-200 μL של 10 mM L-ציסטאין לבאר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. שטפו את הצלחת פעמיים במים סטריליים. הניחו לצלחת להתייבש למשך הלילה במכסה המנוע של תרבית הרקמה כשהמכסה פתוח מעט.
      הערה: ציפוי הצלחת עם L-ציסטאין הוא הכרחי רק בעת השימוש בצלחת בפעם הראשונה.
   3. למחרת, UV-לעקר את הצלחת ואת המכסה במשך 30 דקות. סובב את המכסה כלפי מעלה כך החלק הפנימי מעוקר. לאחר עיקור הצלחת, אין לפתוח את הצלחת מחוץ למכסה הזורם.
2. זריעת תאים במערך ECIS
   1. יש לחמם מראש תמיסת ג'לטין סטרילית 1% באמבט המים למשך 30 דקות
      הערה: התמיסה מאוחסנת במקרר ועלולה להתמצק, מה שמקשה על פיפטה.
   2. לאחר מכן, לצפות את הבארות עם 100 μL של 1 % פתרון ג 'לטין לכל באר לדגור את הצלחת ב 37 ° C לפחות 1 שעות.
   3. שואפים את הג'לטין מהבארות.
   4. ספרו את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי וזרעו את ה-SMCs בטריפליקט בצפיפות זריעה של 30,000 תאים/באר ב-200 מיקרוליטר של תווך SMC.
   5. מניחים את הצלחת עם SMCs לתוך מחזיק ECIS 96-well באינקובטור תרבית התא. לחץ פעמיים על תוכנת ECIS Applied Biophysics כדי לפתוח את התוכנית ולחץ על כפתור ההתקנה.
   6. בדוק אם לכל האלקטרודות יש מגע עם המחזיק (ירוק; אדום אם אין חיבור) בלוח התחתון השמאלי שכותרתו תצורת היטב. אם האלקטרודות אינן מחוברות כראוי, כוונן את הלוח במחזיק לפני תחילת המדידה.
   7. בחר את סוג הלוח (מערך 96 בארות) באותה חלונית על-ידי לחיצה על סוג מערך.
   8. בלוח העליון הימני הגדרת איסוף נתונים, לחץ על תדר יחיד ושנה את ערך העכבה ל- 4000 הרץ ואת המרווח ל- 8 שניות.
   9. לחץ על לחצן התחל כדי להתחיל במדידות. המתן לפתיחת חלונית חדשה, שבה ניתן לשמור את קובץ ECIS.
   10. אפשר לתאים להתחבר וליצור monolayer עבור 48 h.
       הערה: החיבור וההתפשטות של תאים על האלקטרודות יוצרים ערך התנגדות בסיסי (איור 1B).
3. גירוי של תאים כדי לגרום להתכווצות
   1. לגרום להתכווצות SMC על ידי גירוי התאים עם 10 מיקרוגרם / מ"ל של סידן יונופור, ionomycin.
      הערה: יונומיצין יגרום לזרם של Ca²⁺ חוץ-תאי, ויפעיל את מפל ההתכווצות; ראו איור 2A לתמונות מייצגות של תאים מכווצים שאינם מעוררים ומגורים.
   2. לדלל 1 מ"ג של אבקת יונומיצין ב 100 μL של dimethylsulfoxide כדי להפוך פתרון מלאי של 10 מ"ג / מ"ל, ולאחסן 10 μL aliquots ב -20 ° C. לפני השימוש, לדלל את תמיסת היונומיצין 1:10 בתווך SMC כדי להכין את תמיסת העבודה שתתווסף לתאים.
   3. בצע את גירוי התא כאשר המערך עדיין נמצא במחזיק המערך בתוך אינקובטור תרבית התא והאלקטרודות מחוברות למערכת.
      1. כדי לעורר את התאים, להסיר את המכסה ולהניח אותו על משטח סטרילי בתוך האינקובטור. הכינו שתי פיפטות בטמפרטורה של 2 μL ו-150 μL.
      2. לפני תחילת הגירוי, לחץ על Mark בתוכנה ומקם comment.
         הערה: פעולה זו תקל על מציאת העיתוי המדויק של הגירוי בעת ניתוח הנתונים.
      3. פיפטה 2 μL של תמיסת העבודה ionomycin לתוך כל באר מהר ככל האפשר. לאחר שכל התאים עוררו, מערבבים את המדיום בבארות באמצעות פיפטה שנייה.
         הערה: בשל ההשפעות המהירות, אין צורך לשנות טיפים בין שורות תאים ותנאים שונים. עבוד במהירות תוך גירוי וערבוב כי ionomycin יש השפעה חריפה. כאשר מגרים צלחת מלאה, לעורר מקסימום של 3 עמודות בבת אחת. לאחר כל גירוי, המתינו לפחות 30 דקות עד לגירוי הבא כדי לאפשר לתאים להתאושש מהטמפרטורה ומשינוי ה-CO2 שנגרם על ידי פתיחת דלת האינקובטור.
      4. מיד לאחר סיום הגירוי, הקש שוב על סמן כדי להוסיף הערה שהגירוי בוצע.
4. סיום ניסוי הגירוי
   1. רשום את ערכי העכבה במשך כ-5 דקות לאחר גירוי היונומיצין. סיים את ההקלטה על ידי לחיצה על סיום.

תוצאות

איור 1: הגדרת לוח ECIS וייצוג גרפי של התכווצות SMC אבי העורקים. (א) שמאל; צלחת ECIS 96 בארות. אמצע; הגדלה של באר אחת של לוח ECIS, מראה את עשר האלקטרודות בתחתית הבאר. ימין; תמונת מיקרוסקופ אור של SMCs שנזרעו על לוח ECIS; הגדלה פי 10. (B) עקומות התנגדות שנמדדו על ידי ECIS לאחר זריעה של SMCs בקרה במשולש. קו כחול עבה מייצג את הממוצע של המשולש, וקווים מקווקוים מייצגים את ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מערך 96 בארות	ביופיזיקה יישומית	96W10צה"ל PET	מערך המשמש למדידת התכווצות בהגדרת ECIS
כלי דם אנושיים תא שריר חלק מדיום בסיסי (לשעבר "בינוני 231")	גיבקו	M231500	מדיום המשמש לתרבית תאי שריר חלקים
דימתיל סולפוקסיד	סיגמא-אולדריץ'	472301	תמיסה המשמשת לדילול יונומיצין
Invitrogen הרוזנת השנייה	תרמו פישר סיינטיפיק	AMQAX1000	מונה תאים אוטומטי
מלח סידן יונומיצין מקונגלובטוס סטרפטומיצס	סיגמא-אולדריץ'	I0634-1MG	תרכובת המשמשת לגירוי התכווצות
ZTheta	ביופיזיקה יישומית	ZTheta	מכשיר ECIS המשמש למדידות התכווצות