The Gliding Actin Filament Assay: An In Vitro Motility Assay to Study Translocation of Actin Filaments on Immobilized Myosins

תקציר

מקור: Tripathi, A., et al. Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Fluorescence Motility Assays. J. Vis. Exp. (2021).

בסרטון זה, אנו מבצעים בדיקת תנועתיות חוץ גופית כדי לנתח את אינטראקציות אקטין מיוזין. תנועת הגלישה של חוטי אקטין על מולקולות מיוזין משותקות מומחשת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

פרוטוקול

1. בדיקת נימה של אקטין מחליק

1. הכנת Coverslip
   1. הכינו תמיסת ניטרוצלולוז 1% בעמיל אצטט.
   2. מקבלים צלחת תרבית רקמה (150X25 מ"מ) ומוסיפים נייר סינון עגול (קוטר 125 מ"מ) לתחתית המנה.
   3. יש להעמיס שמונה כיסויים מרובעים בעובי 22 מ"מ על מדף ולשטוף עם כ-2-5 מ"ל אתנול 200-200 ואחריו 2-5 מ"ל מים מזוקקים (dH₂O). חזור על שלב הכביסה הזה, מסתיים במים. לאחר מכן, יבשו את הכיסויים לחלוטין באמצעות קו אוויר מסונן או קו N₂.
   4. יש ליטול כיסוי אחד ולאט לאט פיפטה 10 μL של תמיסת ניטרוצלולוז 1% לאורך קצה אחד של ההחלקה. לאחר מכן, בתנועה חלקה אחת, מרחו אותו על שאר הכיסוי באמצעות הצד של קצה פיפטה חלק של 200 μL. הניחו את הכיסוי הזה על צלחת תרבית הרקמה כשצד הניטרוצלולוז כלפי מעלה. יש לחזור על הפעולה עבור שאר הכיסויים ולאפשר להם להתייבש בזמן הכנת הריאגנטים הנותרים, ולהשתמש בכיסויים תוך 24 שעות לאחר הציפוי.
2. הכנת הקאמרי
   1. נגבו שקופית מיקרוסקופ עם נייר עדשה אופטית כדי לנקות פסולת גדולה. חותכים שתי חתיכות של סרט דו צדדי, באורך של כ -2 ס"מ.
   2. הניחו חתיכה אחת לאורך אמצע הקצה הארוך של שקופית המיקרוסקופ. ודא שקצה הקלטת מיושר עם קצה השקופית. הניחו את פיסת הסרט השנייה בערך 2 מ"מ מתחת לסרט הדבק הראשון, כך שהשניים יהיו מקבילים ומיושרים. זה יוצר תא זרימה שיכול להכיל בערך 10 מיקרוליטר של תמיסה (ראו איור 1).
   3. קח את אחד הכיסויים מצופים ניטרוצלולוז מחלק 1. הדביקו בזהירות את הכיסוי על סרט הדבק כך שהצד המצופה בניטרוצלולוז ייצור מגע ישיר עם הסרט (ראו איור 1). באמצעות קצה פיפטה, לחץ בעדינות כלפי מטה על ממשק סרט השקופיות כדי לוודא שהכיסוי נדבק כראוי לשקופית. גזור את הסרט העודף התלוי על קצה המגלשה עם סכין גילוח.
3. הכנת אקטין
   1. ייצור 20 מיקרומטר F-אקטין על ידי פילמור אקטין כדורי (G-אקטין ) במאגר פילמור (50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 25 mM MOPS (pH 7.0) ב 4 ° C למשך הלילה.
   2. לדלל F-אקטין ל-5 מיקרומטר במאגר תנועתיות (20 mM MOPS, 5 mM MgCl₂, 0.1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7.4)). תווית עם עודף מולארי לפחות 1.2x של רודאמין-phalloidin. השאירו (מכוסה ברדיד אלומיניום) לפחות שעתיים על קרח. זה יכול לשמש עד 1-2 חודשים, ומאוחסן על קרח.
4. ביצוע מיוזין 5a דאון אקטין נימה assay
   הערה: בסעיף זה, הפרטים של בדיקת הגלישה מיוזין 5a (HMM) מסופקים.
   1. הכינו את התמיסות למיוזין 5a המתוארות בטבלה 1 ושמרו אותן על קרח.
   2. זרימה ב 10 μL של מיוזין 5a (50-100 ננומטר) דרך תא הזרימה ולחכות 1 דקה.
   3. זרימה פנימה 10 μL של 1 מ"ג / מ"ל BSA ב 50 mM MB עם 1 mM DTT (חיץ "מלח נמוך"). חזור על כביסה זו פעמיים נוספות והמתן דקה לאחר הכביסה השלישית. השתמש בפינה של נייר טישו או נייר סינון כדי לנדף את התמיסה דרך התעלה על ידי מיקום עדין של פינת הנייר ביציאה מתא הזרימה.
   4. יש לכבס עם 10 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT. חזור על שטיפה זו פעמיים נוספות.
   5. זרימה פנימה 10 μL של תמיסת אקטין שחור (5 מיקרומטר F-אקטין , 1 מיקרומטר קלמודולין ו 1 mM ATP ב 50 mM MB עם 1 mM DTT) כדי לחסל "ראשים מתים".
      1. פיפטה הפתרון עם מזרק 1 מ"ל ומחט 27 G כדי לגזור את חוטי אקטין לפני הצגת הפתרון לחדר. חזור על שלב זה פעמיים נוספות והמתן דקה לאחר הפעם השלישית. מספיקים כ-20 אירועי צנרת.
      2. כדי לבצע את סיבוב "הראש המת", הוסף כמות סטויכיומטרית של F-actin למיוזין בנוכחות 1 mM ATP ו- 1 mM MgCl₂ בריכוז מלח של 500 mM. ואז אולטרה-צנטריפוגה ב 480,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 °C (75 °F). המיוזין המת יהיה בכדור.
   6. זרימה פנימה 50 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT ו- 1 mM ATP כדי לרוקן את התא של חוטי אקטין חופשיים.
   7. יש לכבס עם 10 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT. חזור על שטיפה זו פעמיים נוספות כדי לרוקן את החדר של כל ATP.
   8. זרימה פנימה 10 μL של תמיסת רודאמין אקטין (Rh-Actin) של 20 ננומטר המכילה 1 mM DTT ב-50 mM MB והמתן דקה אחת כדי לאפשר קשירה קפדנית של סיבי אקטין למיוזין 5a המחובר לפני השטח של הכיסוי.
   9. יש לשטוף עם 10 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT כדי לשטוף חוטי Rh-Actin שאינם קשורים לפני השטח. חזור על שטיפה זו פעמיים נוספות.
   10. זרימה ב-30 מיקרוליטר של חיץ סופי.
   11. הקלט תמונות במיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות אורך גל עירור של 561 ננומטר כדי להמחיש Rh-Actin. זמן חשיפה מתאים הוא 200 אלפיות השנייה בהספק לייזר של 1.4 mW למשך רכישה כולל של 0.5-1 min.
       הערה: ודא שקצב הרכישה מותאם למהירות החוטים הנעים. שיקול חשוב לפני איסוף נתונים לשימוש עם תוכניות מעקב הוא קצב פריימים הרכישה. תנועות תת-פיקסלים בין מסגרות יגרמו להערכת יתר של המהירות, ונדרשות תנועות של כמה מאות ננומטרים כדי לקבל ערכים מדויקים. קצב רכישה אופטימלי כולל גלישה של אקטין למרחק של פיקסל אחד לפחות בין פריימים. במקרה של מיקרוסקופ TIRF המשמש להדמיה כאן, סף זה מתורגם ל -130 ננומטר; לכן, מיוזין שצפוי לנוע 1 מיקרומטר לשנייה חייב להיות מצולם בקצב של 5 פריימים לשנייה (מרווח של 0.2 שניות) כדי להשיג 200 ננומטר של תנועה, בעוד מיוזין שצפוי לנוע 10 ננומטר לשנייה דורש 0.05 פריימים לשנייה (מרווחים של 20 שניות). לכן ניתן להוריד דגימה של נתונים בשלב זה במידת הצורך.

טבלה 1: מאגרים המשמשים בבדיקת גלישה

שם מאגר	הרכב (M5a)	הרכב (NM2b)	שלבים בשימוש (M5a/NM2b)	הערות
4X מאגר תנועתיות (4X MB)	80 מ"מ MOPS, pH 7.2	80 מ"מ MOPS, pH 7.2		יש לסנן ולאחסן ב-4°C
	20 מ"מ MgCl2	20 מ"מ MgCl2
	0.4 מ"מ EGTA	0.4 מ"מ EGTA
	pH 7.4	pH 7.4
50 mM מאגר תנועתיות מלח (50 mM MB)	25% לעומת V 4X MB	25% לעומת V 4X MB		יש לסנן ולאחסן ב-4°C
	50 מ"מ KCl	50 מ"מ NaCl
	הגבר לעוצמת קול עם dH2O	הגבר לעוצמת קול עם dH2O
500 mM מאגר תנועתיות מלח (500 mM MB)	N/A	25% לעומת V 4X MB		יש לסנן ולאחסן ב-4°C
		500 מ"מ NaCl
		הגבר לעוצמת קול עם dH2O
Myosin	0.05-0.1 מיקרומטר מיוזין	מיוזין 0.2 מיקרומטר	4.2	שמור על קרח.
	1 מ"מ DTT	1 מ"מ DTT
	מדולל ב- 50 mM MB	מדולל ב 500 mM MB
1 מ"ג/מ"ל אלבומין בסרום בקר (BSA)	1 מ"ג/מ"ל BSA	1 מ"ג/מ"ל BSA	4.3	שמור על קרח.
	מדולל ב- 50 mM MB	מדולל ב 500 mM MB
	1 מ"מ DTT	1 מ"מ DTT
5 μM F-actin ללא תווית ב- 50 mM MB (אקטין שחור)	5 מיקרומטר ללא תווית F-אקטין	5 מיקרומטר ללא תווית F-אקטין	4.5	שמור על קרח. גזירת אקטין על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 5-10 פעמים, או באמצעות מזרק.
	1 מיקרומטר קלמודולין (CAM)	1 מ"מ ATP
	1 מ"מ ATP	0.2 מ"מ CaCl2
	מדולל ב- 50 mM MB	1 מיקרומטר קאם
		1-10 ננומטר מיוזין שרשרת קלה קינאז (MLCK)
		מדולל ב- 50 mM MB
MB עם 1 mM DTT ו- 1 mM ATP	1 מ"מ DTT	1 מ"מ DTT	4.6	שמור על קרח.
	1 מ"מ ATP	1 מ"מ ATP
	מדולל ב- 50 mM MB	מדולל ב- 50 mM MB
MB עם DTT	1 מ"מ DTT	1 מ"מ DTT	4.4, 4.7, 4.9	שמור על קרח.
	מדולל ב- 50 mM MB	מדולל ב- 50 mM MB
20 nM רודאמין-פלואידין F-אקטין (Rh-Actin)	20 ננומטר רודאמין-פאלואידין F-אקטין	20 ננומטר רודאמין-פאלואידין F-אקטין	4.8	שמור על קרח. אין לערבל.
	1 מ"מ DTT	1 מ"מ DTT
	מדולל ב- 50 mM MB	מדולל ב- 50 mM MB
Final Buffer	50 מ"מ KCl	0.7% מתילצלולוז (אופציונלי)	4.10	הוסף את הגלוקוז, הגלוקוז אוקסידאז והקטלאז מיד לפני ביצוע הניסוי. שמור על קרח.
	20 mM MOPS, pH 7.2	50 מ"מ NaCl
	5 מ"מ MgCl2	20 mM MOPS, pH 7.2
	0.1 מ"מ EGTA	5 מ"מ MgCl2
	1 מ"מ ATP	0.1 מ"מ EGTA
	50 מ"מ DTT	1 מ"מ ATP
	1 מיקרומטר קלמודולין	50 מ"מ DTT
	2.5 מ"ג/מ"ל גלוקוז	1–10 ננומטר MLCK
	100 מיקרוגרם/מ"ל גלוקוז אוקסידאז	0.2 מ"מ CaCl2
	40 מיקרוגרם/מ"ל קטלאז	1 מיקרומטר קלמודולין
		2.5 מ"ג/מ"ל גלוקוז
		100 מיקרוגרם/מ"ל גלוקוז אוקסידאז
		40 מיקרוגרם/מ"ל קטלאז

תוצאות

איור 1: הכנת תאי זרימה פונקציונליים. (A) התחילו עם שקופית מיקרוסקופ נקייה, שתי פיסות סרט דו-צדדי חתוכות לכ-2 ס"מ, וכיסוי פונקציונלי. (B) הוסף את הקלטת למרכז שקופית המיקרוסקופ. (C) חברו את הכיסוי לסרט כאשר הציפוי (כלומר, ניטרוצלולוז) פונה כלפי מטה ולחצו בעדינות על האזורים החופפים עם הסרט באמצעות קצה פיפטה מפלסטיק כדי לוודא שהכיסוי נדבק לתא.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אמיל אצטט	לאד תעשיות מחקר	10825
ATP	מיליפור סיגמא	A7699
אלבומין בסרום בקר	מיליפור סיגמא	5470
קלמודולין		PMID: 2985564
קטלאז	מיליפור סיגמא	C40
נייר סינון מעגלי - בדיקת גלישה	מיליפור סיגמא	WHA1001125
מתלה Coverslip	מיליפור סיגמא	Z688568-1EA
Coverslips: בדיקת נימה משחקית מחליקה	VWR הבינלאומי	48366-227
DL-Dithiothreitol	מיליפור סיגמא	D0632
סרט דו-צדדי	אופיס דיפו	909955
EGTA	מיליפור סיגמא	E4378
אתנול	פישר סיינטיפיק	A4094
ג'י-אקטין		PMID: 4254541	ניתן לאחסן מלאי G-actin ב 200 מיקרומטר בנוזל N2.
גלוקוז	מיליפור סיגמא	G8270
גלוקוז אוקסידאז	מיליפור סיגמא	G2133
KCl	פישר סיינטיפיק	עמ' 217-500
טיפים לפיפט Large-Orifice	פישר סיינטיפיק	02-707-134
מתילצלולוז	מיליפור סיגמא	M0512
שקופיות מיקרוסקופ	פישר סיינטיפיק	12-553-10
MOPS	פישר סיינטיפיק	BP308-100
ניטרוצלולוז	לאד תעשיות מחקר	10800
סכיני גילוח	אופיס דיפו	397492
רודאמין-פלואידין	תרמופישר סיינטיפיק	₪105	ניתן לדלל את המלאי ב-100% מתנול עד לריכוז סופי של 200 מיקרומטר.
צלחת תרבית רקמות - בדיקת גלישה	קורנינג	353025	כל צלחת תרבית רקמה יכולה להכיל כתשעה כיסויים.
צד חלק 200 μL פיפטה טיפים	תומאס סיינטיפיק	1158U38
ציוד
צנטריפוגה	תרמופישר סיינטיפיק	75006590
מיקרוסקופ	ניקון	דגם: Eclipse Ti עם מערכת H-TIRF עם 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)
מצלמת מיקרוסקופ	אנדור	דגם: מצלמת EMCCD iXon DU888 (פורמט חיישן 1024 x 1024)
תיבת בקרה סביבתית במיקרוסקופ	טוקאי להיט	תיבת תרמי מותאמת אישית
יחידת לייזר מיקרוסקופ	ניקון	LU-n4 ארבע יחידות לייזר עם לייזר מצב מוצק עבור 405nm, 488nm, 561nm ו- 640nm
Optima Max-XP צנטריפוגה שולחנית	בקמן קולטר	393315