בדיקת תנועתיות הפוכה: טכניקה במבחנה לדמיין תנועת מיוזין על חוטי אקטין משותקים

תקציר

מקור: Tripathi, A., et al. Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Fluorescence Motility Assays. J. Vis. Exp. (2021).

בסרטון זה, אנו מבצעים בדיקת תנועתיות חוץ גופית כדי לנתח את אינטראקציות אקטין מיוזין. תנועת הגלישה של חוטי אקטין על מולקולות מיוזין משותקות מומחשת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

פרוטוקול

1. טיהור חלבונים

1. ליזה של תאים ומיצוי חלבונים
   1. הכינו מאגר מיצוי של 1.5x בהתבסס על טבלה 1. יש לסנן ולאחסן בטמפרטורה של 4°C.
   2. התחילו להפשיר את כדורי התא על קרח. בזמן שהכדורים מפשירים, יש להשלים 100 מ"ל של מאגר מיצוי עם 1.2 מ"מ dithiothreitol (DTT), 5 מיקרוגרם / מ"ל leupeptin, 0.5 μM פנילמתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF), ושתי טבליות מעכבי פרוטאז. שמור על קרח.
   3. לאחר הפשרת הכדורית, יש להוסיף 1 מ"ל של מאגר המיצוי המוסף לכל 10 מ"ל תרבית תאים. לדוגמה, אם כדורי התא נוצרו מ 500 מ"ל של תרבית תאים, ולאחר מכן להוסיף 50 מ"ל של מאגר מיצוי בתוספת לכדור.
   4. סוניק את כדורי התא תוך שמירה עליהם על קרח. עבור כל כדור, השתמש בתנאים הבאים: 5 שניות מופעל, 5 שניות כבוי, משך 5 דקות, כוח 4-5.
   5. אספו את כל הליזט ההומוגני לתוך והוסיפו ATP (0.1 M תמיסת מניות; pH 7.0) כך שהריכוז הסופי של ATP הוא 1 מילימול. מערבבים במשך 15 דקות בחדר קר. ה-ATP מנתק מיוזין פעיל מאקטין ומאפשר להפריד אותו בשלב הצנטריפוגה הבא. לכן, חיוני להמשיך לשלב הבא באופן מיידי כדי למזער את האפשרות של דלדול ATP ומחייב מחדש לאקטין.
   6. צנטריפוגה הליזטים ב 48,000 x גרם במשך 1 שעה ב 4 ° C. בזמן שזה קורה, התחל לשטוף 1-5 מ"ל של 50% slurry של שרף זיקה Anti-FLAG (עבור גלולה הנוצרת מ 1 L של תאים) עם 100 מ"ל פוספט חוצץ מלוחים (PBS), על פי הוראות היצרן. לדוגמה, עבור 5 מ"ל של שרף, לשטוף 10 מ"ל של slurry 50%. בשלב השטיפה האחרון, השהה מחדש את השרף עם 1-5 מ"ל של PBS עם נפח מספיק כדי ליצור 50% slurry.
   7. לאחר צנטריפוגת ליזט, ערבבו את הסופרנאטנט עם תרחיף השרף השטוף והתנדנדו בעדינות בחדר הקר למשך 1-4 שעות. בזמן ההמתנה, הכינו את החוצצים המתוארים בטבלה 1 והשאירו אותם על קרח.
2. הכנה לטיהור זיקה של FLAG
   1. צנטריפוגה את התמיסה בשלב 1.7 ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השרף ייארז בתחתית הצינור. מבלי להפריע לשרף, הסירו את הסופרנטנט.
   2. השהה מחדש את השרף ב- 50 מ"ל של חיץ A כמפורט בטבלה 1 וצנטריפוגה ב- 500 x גרם למשך 5 דקות ב- 4 ° C. מבלי להפריע לשרף, הסירו את הסופרנטנט.
   3. השהה מחדש את השרף ב- 50 מ"ל של חיץ B כמפורט בטבלה 1 וצנטריפוגה ב- 500 x גרם למשך 5 דקות ב- 4 ° C. חזור על שלב זה פעם נוספת והשהה מחדש את השרף ב- 20 מ"ל של Buffer B. לאחר מכן, ערבבו היטב את השרף ואת החיץ על ידי היפוך עדין של הצינור ביד כ-10 פעמים.
3. אלוציה וריכוז של חלבונים
   1. צור 30 מ"ל של חיץ אלוציה כמתואר בטבלה 1 ותן לו להתקרר על קרח.
   2. מקמו את עמוד האלוציה בחדר קר. יוצקים בעדינות את תרחיף השרף לתוך העמוד. שטפו את העמוד עם 1-2 נפחים של Buffer B כאשר השרף ארוז בתחתית, כדי להבטיח שהשרף לא יתייבש.
   3. זרימה של 1 מ"ל של חיץ Elution דרך השרף ולאסוף את הזרימה דרך צינור 1.5 מ"ל. חזור כך 12, 1 מ"ל שברים נאספים.
   4. בשלב זה, בצע מבחן ברדפורד גס על השברים כדי לקבוע איכותית אילו שברים הם המרוכזים ביותר. בשורה אחת של צלחת 96 בארות, פיפטה 60 μL 1x מגיב ברדפורד. כאשר שברים נאספים, מערבבים 20 μL של כל שבר לכל באר. צבע כחול כהה יותר מציין את השברים המרוכזים יותר.
   5. בצינור של 50 מ"ל, אספו את החלבון שנותר על ידי הזרמה עדינה של חיץ האלוציה שנותר דרך העמודה, כדי לשחרר את כל שאריות המיוזין הקשורות לשרף בזרימת העמודה. זרימה זו תתרכז בשלב הבא. ודא שהשרף מתחדש לשימוש חוזר ומאוחסן בהתאם להוראות היצרן.
   6. אגרו את שלושת השברים המרוכזים ביותר ורכזו עוד יותר את הזרימה בצינור 50 מ"ל וכן את שברי 1 מ"ל הנותרים באמצעות צינור ריכוז של 100,000 MWCO. טען את הדגימה המאוגמת על צינור הריכוז והצנטריפוגה ב 750 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C וחזור על הפעולה עד שכל החלבון המדולל מרוכז לנפח סופי של כ 0.5-1 mL.
      הערה: גודל נקבוביות זה מאפשר שימור של מולקולות מיוזין, שיש להן מסות פי כמה מהמשקל המולקולרי. שרשראות האור נשארות קשורות היטב לתחומי המנוע במהלך זמן זה של ריכוז, כפי שהוכח על ידי ביצוע אלקטרופורזה בג'ל SDS-PAGE על המוצר הסופי.
4. דיאליזה והקפאת הבזק
   1. צור 2 ליטר של חיץ דיאליזה, כמתואר בטבלה 1. יש להעמיס את הדגימה בשקית דיאליזה או בתא דיאליזה למשך הלילה בחדר הקור.
      הערה: במקרה של M5a-HMM, לאחר דיאליזה לילה, החלבון יהיה טהור מספיק לשימוש בבדיקות הבאות. ניתן לבצע שלבי טיהור נוספים כגון סינון ג'ל או כרומטוגרפיה של חילופי יונים, במידת הצורך.
5. שחזור מיוזין לאחר דיאליזה
   1. עבור M5a-HMM, יש לאסוף בזהירות את הדגימה כולה מתא הדיאליזה והצנטריפוגה בטמפרטורה של 4°C למשך 15 דקות במהירות של 49,000 x גרם למקרה שקיימים אגרגטים לא רצויים. קח את הסופר-נאנט.
6. קביעת ריכוז והקפאת הבזק
   1. כדי לקבוע את ריכוז המוצר, מדדו את הבליעה באמצעות ספקטרופוטומטר באורכי גל 260, 280, 290 ו-320 ננומטר. חשב את הריכוז ב- mg/mL (c_mg/mL) באמצעות משוואה 1, כאשר A₂₈₀ מייצג את הבליעה ב- 280 ננומטר ו- A₃₂₀ מייצג את הבליעה ב- 320 ננומטר. הריכוז המתקבל במ"ג/מ"ל יכול להיות מומר למיקרומטר של מולקולות מיוזין באמצעות משוואה 2, כאשר M הוא המשקל המולקולרי של החלבון כולו (כולל השרשראות הכבדות, השרשראות הקלות, הפלואורופורים וכל התגים).
      c_mg/mL = (A₂₈₀ - A₃₂₀) / ε (1)
      מולקולות μM = 1000c_mg/mL/M (2)
      הערה: אם יש צורך בדילול, יש לעשות זאת בחיץ בעל חוזק יוני גבוה. ניתן לקבוע את מקדם ההכחדה (ε) על ידי ייבוא רצף חומצות האמינו של החלבון לתוכנית כגון ExPASy. התפוקה האופיינית של M5a-HMM היא כ-0.5-1 מ"ל של 1-5 מ"ג/מ"ל חלבון. מקדם ההכחדה של M5a-HMM ששימש במאמר זה היה 0.671.
   2. אחסנו את המיוזין המטוהר באחת משתי הדרכים. Aliquot בין 10-20 μL לתוך צינור דק דפנות, כגון צינור תגובת שרשרת פילמור, ולזרוק את הצינור לתוך מיכל של חנקן נוזלי להקפאת הבזק. לחלופין, יש לשפשף ישירות בין 20-25 מיקרוליטר מיוזין לחנקן נוזלי ולאחסן את חרוזי החלבון הקפואים בצינורות קריוגניים סטריליים. בכל מקרה, ניתן לאחסן את הצינורות המתקבלים ב -80 °C או בחנקן נוזלי לשימוש עתידי.
      הערה: מכיוון שבדיקת תנועתיות המתוארת להלן דורשת כמויות קטנות מאוד של חלבון, אחסון באליציטוטים קטנים, כמתואר, הוא חסכוני.

2. בדיקת TIRF של מולקולה אחת

1. הכנת Coverslip
   1. חלקו את אבקת הציר ל-10 מ"ג אליציטוטים (בצינורות של 1.5 מ"ל) של מתוקסי-פג-סילאן (mPEG) ול-10 מ"ג אליציטוטים של ביוטין-פג-סילאן (bPEG). יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C במיכל אטום וללא לחות ולהשתמש תוך 6 חודשים.
   2. יש להעמיס שמונה כיסויים מרובעים מס' 1.5H (דיוק גבוה) בעובי 22 מ"מ על מדף ולשטוף עם 2-5 מ"ל אתנול 200 חסין ואחריו 2-5 מ"ל מים מזוקקים. חזור על שלב הכביסה הזה, מסתיים במים. לאחר מכן, יבשו את הכיסויים לחלוטין באמצעות קו אוויר או N₂ ונקו פלזמה עם ארגון למשך 3 דקות.
   3. הניחו את הכיסויים הנקיים על נייר פילטר (90 מ"מ) בכלי תרבית טישו (100X20 מ"מ) ודגרו בתנור בטמפרטורה של 70°C תוך ביצוע השלבים הבאים.
      הערה: ניתן להחליף את ניקוי הפלזמה בשיטות ניקוי כימיות אחרות.
   4. הכן תמיסת אתנול 80% עם dH₂O והתאם את ה- pH ל- 2.0 באמצעות HCl. הוסף 1 מ"ל מזה ל- 10 מ"ג aliquot של mPEG ו- 1 מ"ל ל- aliquot של 10 מ"ג של bPEG. מערבולת להתמוסס, אשר לא צריך לקחת יותר מ 30 שניות.
   5. קח 100 μL של תמיסת bPEG ולהוסיף 900 μL של 80% אתנול (pH 2.0). פתרון זה הוא 1 מ"ג / מ"ל bPEG. לאחר מכן, לעשות פתרון של שני PEGs כדלקמן, ערבוב ביסודיות.
      1. 200 μL של 10 מ"ג / מ"ל mPEG (ריכוז סופי: 2 מ"ג / מ"ל).
      2. 10 μL מתוך 1 מ"ג / מ"ל bPEG (ריכוז סופי: 10 מיקרוגרם / מ"ל).
      3. 790 μL של תמיסת 80% אתנול (pH 2.0).
   6. מוציאים את הכיסויים מהתנור. יש לפזר בזהירות 100 מיקרוליטר של תמיסת ה-PEG על מרכז כל כיסוי, ולוודא שרק המשטח העליון רטוב. לאחר מכן, מחזירים את הפתקים לתנור ודגרים במשך 20 עד 30 דקות.
   7. כאשר הכיסויים מתחילים לקבל מראה חורי, עם עיגולים קטנים הנראים על פני השטח, מוציאים אותם מהתנור.
   8. שטפו כל מכסה ב-100% אתנול, ייבשו עם צינור אוויר והחזירו לתנור. לדגור רק למשך הזמן הדרוש ליצירת תאים בשלב 2.
2. הכנת הקאמרי
   1. נקו מגלשת מיקרוסקופ לשימוש בהכנת החדר. חותכים שתי חתיכות של סרט דו צדדי, באורך של כ -2 ס"מ.
   2. הניחו חתיכה אחת לאורך אמצע הקצה הארוך של שקופית המיקרוסקופ. ודא שקצה הקלטת מיושר עם קצה השקופית. הניחו את פיסת הסרט השנייה בערך 2 מ"מ מתחת לסרט הדבק הראשון, כך שהשניים יהיו מקבילים ומיושרים.
   3. קח את אחד הכיסויים פונקציונליים מהתנור (נוצר ב 2.1). הדביקו בזהירות את הכיסוי על סרט הדבקה כך שהצד המצופה ב-PEG יהיה עם הפנים כלפי מטה וייצור מגע ישיר עם סרט ההדבקה, כפי שמוצג באיור 1. באמצעות קצה פיפטה, לחץ בעדינות כלפי מטה על ממשק סרט השקופיות כדי לוודא שהכיסוי נדבק כראוי לשקופית.
   4. גזור את הסרט העודף התלוי מעל המגלשה עם סכין גילוח. ניתן להשתמש בתאים אלה באופן מיידי או למקם אותם בזוג לתוך צינור של 50 מ"ל ולאחסן אותם במקפיא של -80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. חשוב לאחסן מיד או שהמשטח יתכלה.
3. ביצוע בדיקת מיקרוסקופ מיוזין 5a TIRF
   1. הכינו את התמיסות לבדיקת תנועתיות הפוכה מיוזין 5a המתוארת בטבלה 2 ושמרו אותן על קרח.
   2. לשטוף את התא עם 10 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT.
   3. זרימה פנימה 10 μL של 1 מ"ג/מ"ל BSA ב 50 mM MB עם 1 mM DTT. חזור על כביסה זו פעמיים נוספות והמתן דקה לאחר הכביסה השלישית. השתמש בפינה של נייר טישו או נייר סינון כדי לנדף את התמיסה דרך הערוץ.
   4. יש לכבס עם 10 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT. חזור על שטיפה זו פעמיים נוספות.
   5. זרימה פנימה 10 μL של פתרון NeutrAvidin ב 50 mM MB עם 1 mM DTT ולחכות 1 דקה.
   6. יש לכבס עם 10 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT. חזור על שטיפה זו פעמיים נוספות.
   7. זרימה פנימה 10 μL של רודאמין אקטין biotinylated (bRh-Actin) המכיל 1 mM DTT ב 50 mM MB ולחכות 1 דקה. עבור שלב זה, השתמש בקצה פיפטה גדול משועמם והימנע pipeting למעלה ולמטה כדי למזער גזירה של חוטי אקטין פלואורסצנטי כדי להבטיח כי חוטי אקטין ארוכים יכולים להיות מחוברים על פני השטח (20-30 מיקרומטר או יותר). חלופה יעילה היא חיתוך חרוט של קצה פיפטה סטנדרטי (עם פתח של ≈1-1.5 מ"מ).
   8. יש לכבס עם 10 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT. חזור על שטיפה זו פעמיים נוספות.
   9. זרימה ב-30 μL של Final Buffer בתוספת מיוזין 5a של 10 ננומטר, ולאחר מכן העמסה מיידית על מיקרוסקופ TIRF והקלטה לאחר מציאת המיקוד האופטימלי לשיטת הדמיה של TIRF. זמני חשיפה בין 100-200 אלפיות השנייה מתאימים בהספק לייזר של 1.4 mW עבור האקטין והמיוזין המסומן בתווית GFP. זמן רכישה מתאים לניתוח מהירות הוא 3 דקות.

טבלה 1: חוצצים המשמשים לטיהור חלבונים.

שם מאגר	הרכב	שלב(ים) בשימוש	הערות
M5a מאגר חילוץ	0.3 מטר NaCl	1.1	שמור על קרח.
	15 מ"מ MOPS, pH 7.2
	15 מ"מ MgCl2
	1.5 מ"מ EGTA
	4.5 mM NaN3
Buffer A	0.5 מטר NaCl	2.2	שמור על קרח.
	10 mM MOPS, pH 7.2
	0.1 מ"מ EGTA
	3 מ"מ NaN3
	1 מ"מ ATP
	1 מ"מ DTT
	5 מ"מ MgCl2
Buffer B	0.5 מטר NaCl	2.3	שמור על קרח.
	10 mM MOPS, pH 7.2
	0.1 מ"מ EGTA
	3 מ"מ NaN3
	1 מ"מ DTT
Elution Buffer	0.5 מטר NaCl	3.1	שמור על קרח.
	0.5 מ"ג/מ"ל פפטיד דגל
	10 mM MOPS, pH 7.2
	0.1 מ"מ EGTA
	3 מ"מ NaN3
	pH 7.2
M5a מאגר דיאליזה	500 mM KCl	4.1	השתמש ב- dH2O קר כדי להביא לנפח.
	10 מ"מ MgCl2
	10 mM MOPS, pH 7.2
	0.1 מ"מ EGTA
	1 מ"מ DTT

טבלה 2: מאגרים המשמשים בבדיקת TIRF.

שם מאגר	הרכב	שלב(ים) בשימוש	הערות
4X מאגר תנועתיות (4X MB)	80 מ"מ MOPS, pH 7.2		יש לסנן ולאחסן ב-4°C
	20 מ"מ MgCl2
	0.4 מ"מ EGTA
	pH 7.4
50 mM מלח מאגר תנועתיות (50 mM MB)	25% לעומת V 4X MB		יש לסנן ולאחסן ב-4°C
	50 מ"מ KCl
	העלה לעוצמת קול עם dH2O
150 mM מלח מאגר תנועתיות (150 mM MB)			יש לסנן ואחסן בטמפרטורה של 4°C
מיוסין		ראה מתכון "חיץ סופי"	שמור על קרח.
2 מ"ג/מ"ל NeutrAvidin	2 מ"ג/מ"ל NeutrAvidin	3.5	שמור על קרח.
	1 מ"מ DTT
	מדולל ב- 50 mM MB
1 מ"ג/מ"ל אלבומין בסרום בקר (BSA)	1 מ"ג/מ"ל BSA	3.3	שמור על קרח.
	1 מ"מ DTT
	מדולל ב- 50 mM MB
200 nM רודאמין-פאלואידין ביוטיניל F-אקטין (bRh-Actin)	200 ננומטר רודאמין-פאלואדין ביוטינילציה F-אקטין	3.7	הימנע מגזירה על ידי הימנעות מערבולות או פיטום למעלה ולמטה. לערבוב, יש להפוך בעדינות.
	1 מ"מ DTT
	מדולל ב- 50 mM MB
MB עם DTT	50 מ"מ DTT	3.2, 3.4, 3.6, 3.8	שמור על קרח.
	מדולל ב- 50 mM MB
Final Buffer	50 מ"מ KCl	3.9	הוסף את הגלוקוז, הגלוקוז אוקסידאז והקטלאז מיד לפני ביצוע הניסוי. שמור על קרח.
	20 mM MOPS, pH 7.2
	5 מ"מ MgCl2
	0.1 מ"מ EGTA
	1 מ"מ ATP
	50 מ"מ DTT
	1 מיקרומטר קלמודולין
	2.5 מ"ג/מ"ל גלוקוז
	100 מיקרוגרם/מ"ל גלוקוז אוקסידאז
	40 מיקרוגרם/מ"ל קטלאז
	מיוזין 10 ננומטר

תוצאות

איור 1: הכנת תאי זרימה פונקציונליים.(A) התחילו עם שקופית מיקרוסקופ נקייה, שתי פיסות סרט דו-צדדי חתוכות לכ-2 ס"מ, וכיסוי פונקציונלי. (B) הוסף את הקלטת למרכז שקופית המיקרוסקופ. (C) חברו את הכיסוי לסרט כאשר הציפוי פונה כלפי מטה ולחצו בעדינות על האזורים החופפים עם סרט הדבק באמצעות קצה פיפטה מפלסטיק כדי לוודא שהכיסוי נדבק לתא.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2 M MgCl2 פתרון	VWR	10128-298
5 מטר פתרון NaCl	KD מדיקל	RGE-3270
חומצה אצטית	תרמופישר סיינטיפיק	984303
ג'ל זיקה M2 Anti-FLAG	מיליפור סיגמא	A2220	https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATP	מיליפור סיגמא	A7699
ביוטינילציה G-אקטין	Cytoskeleton, Inc.	AB07
אלבומין בסרום בקר	מיליפור סיגמא	5470
bPEG-סילאן	Laysan ביו, Inc	ביוטין-PEG-SIL-3400-1 גרם
רכז מגיב ברדפורד	ביו-ראד	5000006
קלמודולין		PMID: 2985564
קטלאז	מיליפור סיגמא	C40
קו תאים (SF9) ב- SF-900 II SFM	תרמופישר סיינטיפיק	11496015	http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
נייר סינון מעגלי - בדיקה הפוכה	מיליפור סיגמא	WHA1001090
טבליות מעכבות פרוטאז שלמות ונטולות EDTA	מיליפור סיגמא	5056489001	זה צריך להיות מאוחסן ב 4 °C (75 °F). ניתן להשתמש בטבליות ישירות או שניתן לבנות אותן מחדש כתמיסת מלאי 25x על ידי המסת טבליה אחת ב -2 מ"ל מים מזוקקים. הפתרון המתקבל יכול להיות מאוחסן ב 4 ° C במשך 1-2 שבועות או לפחות 12 שבועות ב -20 ° C.
צינורות ריכוז (100,000 MWCO)	חברת EMD Millipore	UFC910024	ה-MWCO של הצינור אינו בהכרח "גודל אחד מתאים לכולם", כל עוד ה-MWCO קטן מהמשקל המולקולרי הכולל של החלבון המטוהר. ה-M5a היה מרוכז עם צינור MWCO של 30,000 MWCO.
Coomassie כחול מבריק R-250 צבע	תרמופישר סיינטיפיק	20278
מתלה Coverslip	מיליפור סיגמא	Z688568-1EA
כיסויים: בדיקת תנועתיות הפוכה	אזר סיינטיפיק	ES0107052
צינורות דיאליזה (3500 דלתון MCWO)	פישר סיינטיפיק	08-670-5א	הקוטר של צינור הדיאליזה יכול להשתנות, אבל MWCO צריך להיות זהה. ניתן לאחסן את הצינורות בתמיסת אלכוהול 20% ב -4 מעלות צלזיוס.
DL-Dithiothreitol	מיליפור סיגמא	D0632
סרט דו-צדדי	אופיס דיפו	909955
DYKDDDDK פפטיד	GenScript	RP10586	ניתן להמיס אותו במאגר המכיל 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3 ו-10 mM MOPS (pH 7.2) לריכוז סופי של 50 מ"ג/מ"ל. זה יכול להיות מאוחסן ב -20 °C כמו 300 μL aliquots.
EGTA	מיליפור סיגמא	E4378
טור Elution	ביו-ראד	761-1550	ניתן לעשות בהם שימוש חוזר. כדי לנקות, שטפו את העמוד עם 2-3 עמודים של PBS ומים מזוקקים. מצננים את העמוד בטמפרטורה של 4°C לפני השימוש.
אתנול	פישר סיינטיפיק	A4094
גלוקוז	מיליפור סיגמא	G8270
גלוקוז אוקסידאז	מיליפור סיגמא	G2133
תמיסת מאגר גליצין, 100 mM, pH 2-2.5, 1 ליטר	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה	SC-295018
HCl	מיליפור סיגמא	320331
KCl	פישר סיינטיפיק	עמ' 217-500
טיפים לפיפט Large-Orifice	פישר סיינטיפיק	02-707-134
מעכב פרוטאז Leupeptin	תרמופישר סיינטיפיק	78435
Mark12 סולם סטנדרטי לא מוכתם	תרמופישר סיינטיפיק	LC5677
מתנול	מיליפור סיגמא	MX0482
שקופיות מיקרוסקופ	פישר סיינטיפיק	12-553-10
MOPS	פישר סיינטיפיק	BP308-100
mPEG-סילאן	Laysan ביו, Inc	MPEG-SIL-2000-1g
NaN3	מיליפור סיגמא	S8032
נויטראבידין	תרמופישר סיינטיפיק	31050
NuPAGE 4 עד 12% Bis-Tris מיני ג'ל חלבון, 15-well	תרמופישר סיינטיפיק	NP0323PK2
מאגר דוגמאות NuPAGE LDS (4X)	תרמופישר סיינטיפיק	NP0007
מלח חוצץ פוספטים, pH 7.4	תרמופישר סיינטיפיק	10010023
PMSF	מיליפור סיגמא	78830	PMSF יכול להיות מיוצר כתמיסת מלאי של 0.1 M באיזופרופנול ומאוחסן ב -4 °C. תוספת איזופרופנול גורמת למשקעים גבישיים, אשר ניתן להמיס על ידי ערבוב בטמפרטורת החדר. מיד לפני השימוש ניתן להוסיף PMSF בתמיסה המערבבת במהירות לריכוז סופי של 0.1 מילימול.
סכיני גילוח	אופיס דיפו	397492
רודאמין-פלואידין	תרמופישר סיינטיפיק	₪105	ניתן לדלל את המלאי ב-100% מתנול עד לריכוז סופי של 200 מיקרומטר.
מדיה Sf9	תרמופישר סיינטיפיק	12658-027	זה צריך להיות מאוחסן ב 4 ° C. חיי המדף שלה הוא 18 חודשים מיום הייצור.
צלחת תרבית רקמות - בדיקה הפוכה	קורנינג	353003	כל צלחת תרבית רקמה יכולה להכיל כארבעה כיסויים.
צד חלק 200 μL פיפטה טיפים	תומאס סיינטיפיק	1158U38
ציוד
צנטריפוגה	תרמופישר סיינטיפיק	75006590
מיקרוסקופ	ניקון	דגם: Eclipse Ti עם מערכת H-TIRF עם 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)
מצלמת מיקרוסקופ	אנדור	דגם: מצלמת EMCCD iXon DU888 (פורמט חיישן 1024 x 1024)
תיבת בקרה סביבתית במיקרוסקופ	טוקאי להיט	תיבת תרמי מותאמת אישית
יחידת לייזר מיקרוסקופ	ניקון	LU-n4 ארבע יחידות לייזר עם לייזר מצב מוצק עבור 405nm, 488nm, 561nm ו- 640nm
צנטריפוגת ספסל אמצעי	תרמופישר סיינטיפיק	דגם: CR3i
מיסוניקס סוניקטור	מיסוניקס	XL2020
Optima Max-XP צנטריפוגה שולחנית	בקמן קולטר	393315
פלסמה-מנקה	Diener אלקטרונית GmbH + ושות' KG	סוג מערכת: Zepto
Sonicator Probe (3.2 מ"מ)	קסוניקה	4418
אינקובטור סטנדרטי	בינדר	דגם: 56
מיקסר צינור Waverly	וייברלי	TR6E