הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
1.3K צפיות
⸱
8 ביולי 2025
מקור: Tripathi, A., et al. Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Fluorescence Motility Assays. J. Vis. Exp. (2021).
בסרטון זה, אנו מבצעים בדיקת תנועתיות חוץ גופית כדי לנתח את אינטראקציות אקטין מיוזין. תנועת הגלישה של חוטי אקטין על מולקולות מיוזין משותקות מומחשת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
1. טיהור חלבונים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
איור 1: הכנת תאי זרימה פונקציונליים.(A) התחילו עם שקופית מיקרוסקופ נקייה, שתי פיסות סרט דו-צדדי חתוכות לכ-2 ס"מ, וכיסוי פונקציונלי. (B) הוסף את הקלטת למרכז שקופית המיקרוסקופ. (C) חברו את הכיסוי לסרט כאשר הציפוי פונה כלפי מטה ולחצו בעדינות על האזורים החופפים עם סרט הדבק באמצעות קצה פיפטה מפלסטיק כדי לוודא שהכיסוי נדבק לתא.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2 M MgCl2 פתרון | VWR | 10128-298 | |
| 5 מטר פתרון NaCl | KD מדיקל | RGE-3270 | |
| חומצה אצטית | תרמופישר סיינטיפיק | 984303 | |
| ג'ל זיקה M2 Anti-FLAG | מיליפור סיגמא | A2220 | https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf |
| ATP | מיליפור סיגמא | A7699 | |
| ביוטינילציה G-אקטין | Cytoskeleton, Inc. | AB07 | |
| אלבומין בסרום בקר | מיליפור סיגמא | 5470 | |
| bPEG-סילאן | Laysan ביו, Inc | ביוטין-PEG-SIL-3400-1 גרם | |
| רכז מגיב ברדפורד | ביו-ראד | 5000006 | |
| קלמודולין | PMID: 2985564 | ||
| קטלאז | מיליפור סיגמא | C40 | |
| קו תאים (SF9) ב- SF-900 II SFM | תרמופישר סיינטיפיק | 11496015 | http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf |
| נייר סינון מעגלי - בדיקה הפוכה | מיליפור סיגמא | WHA1001090 | |
| טבליות מעכבות פרוטאז שלמות ונטולות EDTA | מיליפור סיגמא | 5056489001 | זה צריך להיות מאוחסן ב 4 °C (75 °F). ניתן להשתמש בטבליות ישירות או שניתן לבנות אותן מחדש כתמיסת מלאי 25x על ידי המסת טבליה אחת ב -2 מ"ל מים מזוקקים. הפתרון המתקבל יכול להיות מאוחסן ב 4 ° C במשך 1-2 שבועות או לפחות 12 שבועות ב -20 ° C. |
| צינורות ריכוז (100,000 MWCO) | חברת EMD Millipore | UFC910024 | ה-MWCO של הצינור אינו בהכרח "גודל אחד מתאים לכולם", כל עוד ה-MWCO קטן מהמשקל המולקולרי הכולל של החלבון המטוהר. ה-M5a היה מרוכז עם צינור MWCO של 30,000 MWCO. |
| Coomassie כחול מבריק R-250 צבע | תרמופישר סיינטיפיק | 20278 | |
| מתלה Coverslip | מיליפור סיגמא | Z688568-1EA | |
| כיסויים: בדיקת תנועתיות הפוכה | אזר סיינטיפיק | ES0107052 | |
| צינורות דיאליזה (3500 דלתון MCWO) | פישר סיינטיפיק | 08-670-5א | הקוטר של צינור הדיאליזה יכול להשתנות, אבל MWCO צריך להיות זהה. ניתן לאחסן את הצינורות בתמיסת אלכוהול 20% ב -4 מעלות צלזיוס. |
| DL-Dithiothreitol | מיליפור סיגמא | D0632 | |
| סרט דו-צדדי | אופיס דיפו | 909955 | |
| DYKDDDDK פפטיד | GenScript | RP10586 | ניתן להמיס אותו במאגר המכיל 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3 ו-10 mM MOPS (pH 7.2) לריכוז סופי של 50 מ"ג/מ"ל. זה יכול להיות מאוחסן ב -20 °C כמו 300 μL aliquots. |
| EGTA | מיליפור סיגמא | E4378 | |
| טור Elution | ביו-ראד | 761-1550 | ניתן לעשות בהם שימוש חוזר. כדי לנקות, שטפו את העמוד עם 2-3 עמודים של PBS ומים מזוקקים. מצננים את העמוד בטמפרטורה של 4°C לפני השימוש. |
| אתנול | פישר סיינטיפיק | A4094 | |
| גלוקוז | מיליפור סיגמא | G8270 | |
| גלוקוז אוקסידאז | מיליפור סיגמא | G2133 | |
| תמיסת מאגר גליצין, 100 mM, pH 2-2.5, 1 ליטר | סנטה קרוז ביוטכנולוגיה | SC-295018 | |
| HCl | מיליפור סיגמא | 320331 | |
| KCl | פישר סיינטיפיק | עמ' 217-500 | |
| טיפים לפיפט Large-Orifice | פישר סיינטיפיק | 02-707-134 | |
| מעכב פרוטאז Leupeptin | תרמופישר סיינטיפיק | 78435 | |
| Mark12 סולם סטנדרטי לא מוכתם | תרמופישר סיינטיפיק | LC5677 | |
| מתנול | מיליפור סיגמא | MX0482 | |
| שקופיות מיקרוסקופ | פישר סיינטיפיק | 12-553-10 | |
| MOPS | פישר סיינטיפיק | BP308-100 | |
| mPEG-סילאן | Laysan ביו, Inc | MPEG-SIL-2000-1g | |
| NaN3 | מיליפור סיגמא | S8032 | |
| נויטראבידין | תרמופישר סיינטיפיק | 31050 | |
| NuPAGE 4 עד 12% Bis-Tris מיני ג'ל חלבון, 15-well | תרמופישר סיינטיפיק | NP0323PK2 | |
| מאגר דוגמאות NuPAGE LDS (4X) | תרמופישר סיינטיפיק | NP0007 | |
| מלח חוצץ פוספטים, pH 7.4 | תרמופישר סיינטיפיק | 10010023 | |
| PMSF | מיליפור סיגמא | 78830 | PMSF יכול להיות מיוצר כתמיסת מלאי של 0.1 M באיזופרופנול ומאוחסן ב -4 °C. תוספת איזופרופנול גורמת למשקעים גבישיים, אשר ניתן להמיס על ידי ערבוב בטמפרטורת החדר. מיד לפני השימוש ניתן להוסיף PMSF בתמיסה המערבבת במהירות לריכוז סופי של 0.1 מילימול. |
| סכיני גילוח | אופיס דיפו | 397492 | |
| רודאמין-פלואידין | תרמופישר סיינטיפיק | ₪105 | ניתן לדלל את המלאי ב-100% מתנול עד לריכוז סופי של 200 מיקרומטר. |
| מדיה Sf9 | תרמופישר סיינטיפיק | 12658-027 | זה צריך להיות מאוחסן ב 4 ° C. חיי המדף שלה הוא 18 חודשים מיום הייצור. |
| צלחת תרבית רקמות - בדיקה הפוכה | קורנינג | 353003 | כל צלחת תרבית רקמה יכולה להכיל כארבעה כיסויים. |
| צד חלק 200 μL פיפטה טיפים | תומאס סיינטיפיק | 1158U38 | |
| ציוד | |||
| צנטריפוגה | תרמופישר סיינטיפיק | 75006590 | |
| מיקרוסקופ | ניקון | דגם: Eclipse Ti עם מערכת H-TIRF עם 100x TIRF Objective (N.A. 1.49) | |
| מצלמת מיקרוסקופ | אנדור | דגם: מצלמת EMCCD iXon DU888 (פורמט חיישן 1024 x 1024) | |
| תיבת בקרה סביבתית במיקרוסקופ | טוקאי להיט | תיבת תרמי מותאמת אישית | |
| יחידת לייזר מיקרוסקופ | ניקון | LU-n4 ארבע יחידות לייזר עם לייזר מצב מוצק עבור 405nm, 488nm, 561nm ו- 640nm | |
| צנטריפוגת ספסל אמצעי | תרמופישר סיינטיפיק | דגם: CR3i | |
| מיסוניקס סוניקטור | מיסוניקס | XL2020 | |
| Optima Max-XP צנטריפוגה שולחנית | בקמן קולטר | 393315 | |
| פלסמה-מנקה | Diener אלקטרונית GmbH + ושות' KG | סוג מערכת: Zepto | |
| Sonicator Probe (3.2 מ"מ) | קסוניקה | 4418 | |
| אינקובטור סטנדרטי | בינדר | דגם: 56 | |
| מיקסר צינור Waverly | וייברלי | TR6E |
