$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית
1. רגישות פסיבית של תאי huRBL
- צנטריפוגה את מתלה Ag8/סרום מודגר מראש למשך 5 דקות ב 250 x גרם.
- העבירו 50 μL של תרחיף Ag8/סרום צנטריפוגי לכל באר המכילה תאי huRBL מבלי להפריע לכדורית תא Ag8.
- כלול את הבקרה ללא אנטיגן, שהם רגישים, אך תאים לא מגורה (לא להוסיף אנטיגן), המשמש אינדיקציה עבור רמת האות התחתונה / רקע. רקע ובארות בקרת ליזה מקסימלית לא צריך להיות רגיש עם סרום. הוסף 50 μL של מדיום huRBL כדי לשלוט בארות במקום.
- מכסים את הצלחת במכסה ודגרים למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C ו-5%-7% CO2.
2. גרגיר מגורה אנטיגן ושחרור מתווך
- הכינו מראש את דילול האנטיגן במאגר 1x Tyrode (מלחי Tyrode 9.5 גרם/ליטר, אלבומין בסרום בקר 0.1% (BSA), 0.5 גרם/ליטר נתרן מימן פחמתי (NaHCO3) ב-dH2O). יש צורך בסכום סופי של 100 μL לכל באר.
הערה: לא כל אלרגן, מטוהר ממקורות טבעיים או מיוצר באופן רקומביננטי, עשוי להיות יציב במאגר 1x Tyrode. לכן, בצע בדיקות יציבות בחיץ 1x Tyrode לפני הליך הבדיקה. לחלופין, יש לדלל את החיץ של 1x Tyrode בתחמוצת דאוטריום (D2O) כדי להגדיל את יחס האות לרעש של הבדיקה.
- בצע 8 דילולים של האנטיגן המעניין של סדרת דילול 1:10 בצינורות תגובה החל מ 10 או 1 מיקרוגרם / מ"ל של חלבון.
הערה: בדוק תמיד את סדרת הדילול מראש. לחלופין, התאימו את סדרת הדילול 1:10 (לדוגמה, 1:5, 1:20 או 1:30) כדי לכסות את עקומת השחרור המלאה. בנוסף, הריכוז ההתחלתי יכול להשתנות בהתאם למערך הניסוי.
- כדי לשטוף תאי huRBL המצופים על צלחת 96 בארות, הסר תחילה את תווך התא המכיל סרה על ידי שאיפה, היפוך והקשה בזהירות על הצלחת על נייר סופג.
- לשטוף תאים עם 200 μL של 1x חיץ Tyrodes לכל באר. התייחס לכל הבארות באופן דומה.
הערה: הוסיפו את תמיסת הכביסה באיטיות לתאים כדי לא להפריע להם.
- השאירו אותו למשך כ-30 שניות וחזרו על שלב הכביסה שלוש פעמים בסך הכל.
- לאחר הוספת תמיסת השטיפה בפעם הסופית, השאירו את התמיסה בבארות עד שתהיה מוכנה להמשיך בהוספת דילול האנטיגן.
הערה: הימנעו מחשיפת תאים לאוויר למשך זמן רב מדי.
- להעביר 100 μL של תמיסת אנטיגן לכל באר המכילה את תאי huRBL רגישים מראש.
הערה: אם אתה מנתח מספר פרמטרים שונים, העבר את הדגימות הבודדות של סדרת הדילול לצלחת נוספת שאינה מחייבת 96 בארות (השתמש באותה פריסה כמו על צלחת huRBL) והעבר אותן לאחר מכן עם פיפטה רב ערוצית ישירות על צלחת התא huRBL. בדרך זו, ניתן להימנע מחשיפת התאים לאוויר למשך זמן רב מדי, מה שעלול לגרום לביצועי בדיקה גרועים (אות נמוך / ללא אות).
- מכסים בארות בקרה (מקסימום ליזה ותאי רקע לא רגישים) עם 100 μL של חיץ 1x Tyrode. אין לעורר בארות שליטה אלה עם האנטיגן.
- בנוסף, הוסף 100 μL של חיץ 1x Tyrode לבארות ללא אנטיגן רגישות של סדרת הדילול, אשר נדרש כדי לקחת בחשבון את השחרור הספונטני הבלתי תלוי באנטיגן של תאים רגישים במהלך ניתוח הנתונים.
- לדגור על תאי huRBL במשך שעה אחת ב-37°C ו-5%-7% CO2.
3. מדידת פלואורסצנטיות של פעילות β-הקסוזמינידז
- לטפל בארות של בקרת ליזה מקסימלית עם 10 μL של 10% Triton X-100 לכל באר ולערבב כראוי על מנת lyse את התאים לחלוטין ולקבל את שחרור 100% של β-hexosaminidase.
- הוסף 50 μL של תמיסת מצע לתוך צלחת חדשה שאינה מחייבת 96 בארות. פתרון מצע עבור צלחת אחת 96 בארות: 5 מ"ל של 0.1 M חיץ מבחן לימון, pH 4.5; ו 80 μL של 10 mM 4-methylumbelliferyl N-אצטיל-β-D-glucosaminide.
- העברת 50 μL של תא supernatant של כל הבארות לצלחת החדשה המכילה את פתרון המצע.
הערה: פיפטה הסופרנאטנט בזהירות מצלחת huRBL כדי לא להפריע לתאי huRBL.
- לדגור על הצלחת עם תמיסת המצע וסופרנאטנט התא למשך שעה אחת ב 37 ° C כדי לאפשר המרה של המצע הפלואורוגני.
הערה: שמור את צלחת huRBL לבדיקת כדאיות התא.
- הוסף 100 μL של תמיסת עצירה (15 גרם / ליטר גליצין, 11.7 גרם / ליטר NaCl מומס ב dH2O, pH 10.7) לכל באר.
- מדוד את הפלואורסצנטיות בעירור של 360 ננומטר ובפליטה של 465 ננומטר באמצעות קורא לוחות.