$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. עיכוב גדילה סינון תפוקה גבוהה (HTS)
הערה: הפעילות מעכבת הגדילה של חומרים אנטי-סרטניים כנגד אורגנואידים סרטניים (PDOs) שמקורם במטופל מוערכת על-ידי מדידת תכולת ה-ATP התוך-תאית, כפי שמוצג באיור 1. שלב זה מתבצע באמצעות ערכת בדיקת כדאיות תאים זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).
- ביום 0, תרבית את PDOs (למשל, RLUN007) בצלוחיות עד למספר מספיק של אשכולות תאים זמינים עבור הבדיקה. יום לפני הזריעה, העבירו את מתלה ה-PDO מבקבוקבגודל 75 ס"מ לצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 2 דקות כדי למדוד את נפח כדורי ה-PDO. לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולת PDO ב 15 מ"ל של בינוני טרי ולהעביר אותו בחזרה 75 ס"מ2 צלוחיות. תרבית את התאים ב 37 ° C ב 5% CO2.
הערה: נפח כדורי PDO הנדרש תלוי בקצב הדילול של כל PDO ובמספר לוחות 384 בארות המשמשים לבדיקה. עבור RLUN007, נפח של 200 מיקרוליטר של כדורי התא נחוץ לזריעה לעשר צלחות 384 בארות.
- ביום הראשון (24 שעות לאחר החלפת התווך), טחנו את PDOs באמצעות ציוד פיצול ופיזור תאים (ראה טבלת חומרים) עם מחזיק מסנן המכיל מסנן רשת 70 מיקרומטר. לאחר מכן, לדלל 15 מ"ל של מתלה PDO על ידי 10x. זרע 40 μL של תרחיף PDO לתוך 384-באר חיבור נמוך במיוחד spheroid (תחתית עגולה) microplates (ראה טבלה של חומרים) באמצעות מתקן תרחיף התא (ראה טבלה של חומרים).
הערה: לטחינת צבירי תאים, מומלץ להשתמש בציוד המסחרי לפיצול ופיזור תאים (ראו טבלת חומרים).
- 24 שעות לאחר הזריעה (יום 2), טפל ב- PDOs עם 0.04 μL של תמיסות סוכן בדיקה בטווחי ריכוז סופיים של 20 מיקרומטר עד 1.0 ננומטר (10 דילולים סדרתיים) באמצעות מטפל בנוזלים (ראה טבלת חומרים).
- ביום 8 (144 שעות לאחר טיפול בחומרי בדיקה), הוסף מגיב מדידת ATP תוך תאי לבארות הבדיקה. ערבבו את הצלחות בעזרת מיקסר ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורה של 25°C. מדדו את תכולת ה-ATP התוך-תאית כהארה באמצעות קורא לוחות (ראו טבלת חומרים).
- כדי לחשב את כדאיות התא, חלק את כמות ה- ATP בבארות הבדיקה בזו שבבארות הבקרה המכילות את הרכב, עם הפחתת הרקע. כדי לחשב את קצב הצמיחה במשך 6 ימים, חלק את כמות ה- ATP בבארות בקרת הרכב בזו שבבארות בקרת הרכב 24 שעות לאחר הזריעה.
- חשב את ערכי הריכוז המעכב של 50% (IC50) ואת השטח מתחת לעקומה (AUC) מעקומות המינון-תגובה באמצעות תוכנה לניתוח נתונים ביולוגיים (ראה טבלת חומרים). גורם Z הוא פרמטר חסר ממד הנע בין 1 (הפרדה אינסופית) ל- <0, המוגדר כ- Z = 1 - (3σc+ + 3σc-) / |μc+ - μc-|, כאשר σc+, σc-, μc+ ו- μc- הם סטיות התקן (σ) והממוצעים (μ) של הפקדים הגבוהים (c+) והנמוכים (c−), בהתאמה.
