פעולה נימית רדיאלית דיפרנציאלית של בדיקת ליגנד: טכניקה בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי נוקלאוטיד חיידקי חלבונים תוך-תאיים קושרי שליח שני

1. הכנת ליזטים של תאים שלמים

1. יש לחסן את זני האוסף E. coli K-12 ASKA ORFeome למרק ליזוגני בנפח 1.5 מ"ל (LB) המכיל 25 מק"ג/מ"ל כלוראמפניקול בצלחות באר עמוקות של 96 בארות. יש לגדול למשך הלילה (O/N) במשך 18 שעות ב-30°C עם רעידות ב-160 סל"ד. למחרת, הוסף איזופרופיל β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (סופי 0.5 mM) לתרביות O/N כדי לגרום לביטוי חלבון ב 30 ° C במשך 6 שעות.
2. תאי גלולה ב 500 x גרם במשך 10 דקות. להקפיא את הכדוריות ב -80 ° C עד לשימוש. כדי ליזה את התאים, להוסיף 150 μL של חיץ ליזה L1 (40 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, בתוספת 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 40 μg / mL DNase 1, ו 0.5 מ"ג / מ"ל lysozyme) כדי להשעות מחדש את הכדור.
3. הקפיאו את התאים בטמפרטורה של -80°C למשך 30 דקות, ולאחר מכן הפשירו בטמפרטורה של 37°C למשך 20 דקות. חזרו על מחזור זה שלוש פעמים כדי ללטש את התאים. יש לאחסן את הליזטים בטמפרטורה של -80°C לפני השימוש.

2. טיהור של Rel_seq ו- GppA

הערה: החלבונים הרקומביננטיים Rel_seq מ- Streptococcus equisimilis ו- GppA מ- E. coli K-12 משמשים לסנתזה של pppGpp ו- ppGpp המסומנים ברדיו, בהתאמה.

1. לגדל ולאסוף תאים המבטאים יתר על המידה כל חלבון.
   1. הגדילו את זן E. coli BL21 DE3 עד לשלב מעריכי (צפיפות אופטית (OD) ~0.3-0.4) בציר LB, וסובבו 1 מ"ל של תרבית ב-6000 x גרם למשך 5 דקות. דקרו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את התאים עם 100 מיקרוליטר של ציר TSB קר כקרח (ציר LB בתוספת 0.1 גרם/מ"ל PEG3350, 0.05 מ"ל/מ"ל דימתיל-סולפוקסיד, 20 mM MgCl₂).
   2. ערבבו את הפלסמידים הנושאים את ה-relseq וה-gppA המסומנים בהיסטידין, כל אחד ב-100 ננוגרם, עם מתלי התאים הנ"ל ב-TSB, ודגרו על קרח במשך 30 דקות. הלם חום את התאים ב-42°C למשך 40 שניות. הניחו את התערובת על קרח למשך 2 דקות, והוסיפו 1 מ"ל של ציר LB בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לתאים להתאושש במשך שעה אחת ב-37°C עם תסיסה ב-160 סל"ד.
   3. צלחת את התאים שהתאוששו על צלחות אגר LB בתוספת אנטיביוטיקה המתאימה (Rel_seq: 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין; GppA: 30 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin). למחרת, לחסן את המושבות במרק LB כדי להתחיל O/N precultures של שני הזנים ב 37 ° C.
   4. לאחר 18 שעות, לחסן 500 מ"ל של LB בינוני עם 10 מ"ל של תרביות O/N ואת האנטיביוטיקה המתאימים. לגדל את התרביות על ידי טלטול ב 160 סל"ד ב 37 ° C. כאשר OD_600nm מגיע 0.5-0.7, לגרום ביטוי חלבון על ידי הוספת 0.5 mM IPTG וגדל במשך 3 שעות ב 30 ° C עם רעד ב 160 סל"ד.
   5. אסוף את התאים על ידי סיבוב ב 6084 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. להשהות מחדש את הגלולה ב 20 מ"ל של 1x מי מלח חוצצים פוספט קר כקרח (PBS), וצנטריפוגה מחדש ב 1912 x גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C. דקר את supernatant, והקפיא את הכדוריות ב -20 ° C לפני השימוש.
2. ניקל-ניטרילוטריאצטית חומצה (Ni-NTA) זיקה לטיהור
   הערה: מנקודה זו ואילך, ודא שהדגימות קרות.
   1. הוסף 40 מ"ל של חיץ ליזיס קר כקרח L2 (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 5% גליצרול, 10 mM imidazole, 10 mM β-mercaptoethanol בתוספת מעכבי פרוטאז (טבליה ללא EDTA; ראה טבלת חומרים) כדי להשעות מחדש את הכדור. Lyse את התאים באמצעות סוניקציה (60% משרעת, 2 s on / 4 s כבוי במשך 8 דקות על). נקה את הליזט על ידי סיבוב ב 23,426 x גרם במשך 40 דקות ב 4 ° C, ולהמשיך עם supernatant לטיהור.
   2. במהלך הצנטריפוגה הנ"ל מכינים את שרף ני-נת"ע.
      1. העבירו 500 מיקרוליטר של שרף Ni-NTA הומוגני לעמוד כרומטוגרפיה מפוליפרופילן עומד, והניחו לו להסתפק במשך 15 דקות ותמיסת האחסון תתרוקן. לשטוף את השרף עם 15 מ"ל של מים טהורים פעמיים, ולאחר מכן לשטוף את העמוד עם 15 מ"ל של חיץ ליזיס L2.
   3. טען את הסופרנאטנט המנוקה של התא ליזט משלב 1 אל העמודה, ותן לו לזרום דרכה. שטפו את העמוד עם 30 מ"ל של חיץ כביסה (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 5% גליצרול, 20 mM imidazole).
   4. יש להקפיד על החלבונים עם 400 μL של חיץ האלוציה (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 5% glycerol, 500 mM imidazole) שלוש פעמים. לאחר מכן, חזור על elution עם עוד 300 μL של מאגר elution. ערבבו את החלבונים המדוללים לנפח סופי של 700 μL.
3. סינון ג'ל
   1. הכינו חיץ סינון ג'ל (50 mM Tris, pH 7.5; 200 mM NaCl; 5% גליצרול). שטוף את עמודת אי הכללת הגודל בנפח עמודה אחת (25 מ"ל) של מאגר סינון הג'ל.
   2. טען את הדגימה לעיל של 700 μL באמצעות לולאה של 500 μL, הפעל במהירות של 0.5 מ"ל/דקה, ואסוף 2-3 שברים, כל אחד בנפח 0.5 מ"ל, המכיל את החלבונים המתאימים.
   3. ערבבו ורכזו את השברים המכילים כל אחד מהחלבונים באמצעות עמודת ספין, ומדדו את ריכוז החלבון באמצעות מבחן ברדפורד.

3. סינתזה של ³²pppGpp ו-ppGpp עם תווית P

1. הרכיבו תגובת Rel_seq בקנה מידה קטן בצינור מכסה בורג (ראה טבלה 1).
   הערה: עבודה עם ריאגנטים רדיואקטיביים רק במקום מורשה ועם ציוד מגן אישי.
2. יש לדגור על הצינור בטמפרטורה של 37°C בתרמומיסר למשך שעה אחת, לאחר מכן בטמפרטורה של 95°C למשך 5 דקות, ולהניח על קרח למשך 5 דקות. סובבו את החלבון המואץ במהירות של 15,700 x גרם למשך 5 דקות, והעבירו את הסופרנאטנט (^{מסונתז 32}P-pppGpp) לצינור מכסה בורג חדש.
3. כדי לסנתז ³²P-ppGpp ^מ-32P-pppGpp, העבר מחצית מהמוצר ³²P-pppGpp לצינור מכסה בורג חדש, והוסף 1 μM GppA. יש לדגור על הצינור בטמפרטורה של 37°C למשך 10 דקות, בטמפרטורה של 95°C למשך 5 דקות, ולאחר מכן להניח על קרח למשך 5 דקות.
4. סובבו מטה את החלבון המואץ במהירות של 15,700 x גרם למשך 5 דקות, והעבירו את הסופרנאטנט (^{מסונתז 32}P-ppGpp) לצינור מכסה בורג חדש.
5. נתח את ³²P-pppGpp ו- ³²P-ppGpp על ידי הפעלת 1 μL של הדגימות על לוח כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) (לוחות TLC של תאית פוליאתילניאמין) באמצעות 1.5 M KH₂PO₄, pH 3.4, כשלב נייד.
   הערה: השתמש בגואנוזין 5'-טריפוספט עם תווית P ^α-32P-α-GTP כבקרה.
6. יבשו את צלחת TLC לחלוטין, הניחו אותה בין תיקיית פלסטיק שקופה וחשפו אותה למסך זרחן אחסון למשך 5 דקות. דמיינו וכמתו את האותות באמצעות phosphorimager.
   הערה: כאשר היחסים של ³²P-pppGpp ^ו-32P-ppGpp גבוהים מ-85%, ניתן להרכיב ולסנתז תגובה בקנה מידה גדול (500 μL, מספיק להקרנת 20 לוחות 96 בארות) באמצעות טבלה 1.

4. בדיקת DRaCALA של חלבוני המטרה של (p)ppGpp

1. הפשירו והעבירו 20 μL של ליזטים שלמים של תאים שלמים לצלחת מיקרוטיטר בעלת תחתית V בעלת 96 בארות. הוסיפו 2.5 U/well של האנדונוקלאז מ-Serratia marcescens, ודגרו ב-37°C למשך 15 דקות כדי להפחית את צמיגות הליזט. מניחים את הליזטים על קרח למשך 20 דקות.
2. ערבב את ³²P-pppGpp ו- ³²P-ppGpp ביחס של 1:1, והוסף 1x lysis buffer L1 כדי שהריכוז הסופי של (p)ppGpp יהיה שווה ל- 4 nM.
   הערה: בהתחשב בדמיון הכימי בין pppGpp ו- ppGpp, שילוב של שני הכימיקלים יפשט את תהליך הסינון.
3. השתמש פיפטה רב ערוצית וקצות פיפטה מסוננים כדי להוסיף ולערבב 10 μL של תערובת (p)ppGpp עם ליזט התא. יש לדגור בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות.
4. שטפו את הכלי 96 x פינים על ידי הנחתו בתמיסה 0.01% של חומר ניקוי לא יוני למשך 30 שניות, וייבשו אותו על נייר טישו למשך 30 שניות. חזרו על שטיפת כלי הסיכה 3x.
5. הניחו את כלי הסיכה בלוחות הדגימה הנ"ל בעלי 96 בארות, והמתינו 30 שניות. הרימו את כלי הסיכה ישר למעלה, והניחו אותו ישר על קרום ניטרוצלולוז למשך 30 s.
   הערה: אם חסר כתם, נקודתי 2 μL של הדגימות המתאימות עם פיפטה וקצוות מסוננים. מומלץ לבצע נקודה כפולה של אותו מדגם כמצוין להלן.
6. יבשו את הממברנה במשך 5 דקות ב-RT. הניחו את הממברנה בין תיקיית פלסטיק שקופה וחשפו אותה למסך אחסון זרחני למשך 5 דקות. דמיינו באמצעות זרחן.

5. כימות וזיהוי חלבוני מטרה פוטנציאליים

1. השתמש בתוכנת הניתוח המשויכת ל- phosphorimager כדי לפתוח את קובץ ה- .gel של הלוחות החזותיים. השתמש בפונקציית ניתוח המערך כדי להגדיר את 96 המקומות על-ידי הגדרת רשת של 12 עמודות x 8 שורות.
2. הגדירו עיגולים גדולים כך שיקיפו את הקצה החיצוני של כל הנקודות (ראו איור 1). יצא את Volumn+רקע ואזור של העיגולים הגדולים המוגדרים, ושמור בגיליון אלקטרוני.
   הערה: במידת הצורך, מקמו מחדש כל עיגול בנפרד כך שיחפוף באופן מושלם עם הנקודות, ושנו את גודלו של כל עיגול בנפרד כדי שיהיה מעט גדול יותר מהנקודה בפועל.
3. הקטינו את העיגולים המוגדרים כדי להקיף את הנקודות הפנימיות הקטנות. יצא את Volumn+Background ואת האזור של העיגולים הקטנים שהוגדרו, ושמור בגיליון אלקטרוני.
4. חשב את שברי האיגוד בגיליון האלקטרוני באמצעות המשוואה באיור 1, והתווה את הנתונים. זהה את חלבוני הקישור הפוטנציאליים בבארות המראים שברים קושרים גבוהים בהשוואה לרוב הבארות האחרות.

טבלה 1: איסוף מידע עבור תגובות סינתזה בקנה מידה קטן וגדול של ³²pppGpp המסומן P. *מאגר Relseq 10x מכיל 250 mM Tris-HCl, pH 8.6; 1M NaCl; 80 mM MgCl₂. קיצור: pppGpp = guanosine pentaphosphate.

איור 1: כימות וחישוב המקטע המחייב. עיין בטקסט לקבלת פרטים. בקצרה, כתמי DRaCALA ינותחו על ידי ציור שני עיגולים התוחמים את כל הכתם ואת הנקודה הכהה הפנימית (כלומר, הנקודה השמורה (p)ppGpp עקב קשירת החלבון הנבדק). אות הקישור הספציפי הוא האות הרדיואקטיבי של המעגל הפנימי (S1) לאחר חיסור אות הרקע הלא ספציפי (מחושב על ידי A1 × ((S2-S 1)/(A2-A 1))). שבר הקישור הוא אות הקישור הספציפי חלקי האות הרדיואקטיבי הכולל (S2). קיצורים: DRaCALA = פעולה נימית רדיאלית דיפרנציאלית של בדיקת ליגנד; (p)ppGpp = גואנוזין פנטה וטטרפוספטים; RT = טמפרטורת החדר.