בדיקת הדמיה פלואורסצנטית: טכניקה להמחשת עקה חמצונית בתאי אורגנואיד בתרבית של מיני חמצן תגובתי שטופלו על ידי השראת תאים אורגנואידים במעי

תקציר

מקור: Stedman, A. et al., ניתוח עקה חמצונית באורגנואידים במעי מורין באמצעות בדיקה פלואורוגנית רגישה לחמצן תגובתי. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מתאר את הטכניקה של הדמיה של עקה חמצונית באורגנואידים בתרבית. עבודה זו מסייעת בהבנת רמת העקה החמצונית עקב הצטברות ROS בסוגי התאים השונים הקיימים באורגנואיד לאחר טיפול במודולטורים שונים של ROS.

פרוטוקול

1. הדמיה של עקה חמצונית באורגנואידים תלת-ממדיים במיקרוסקופ קונפוקלי

1. קח את האורגנואידים המצופים בתאי הקידוח μ-Slide 8 והוסף 1 μL N-אצטיל ציסטאין או תמיסת מלאי NAC בבארות המתאימות כדי לקבל ריכוז סופי של 1 mM.
2. יש לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
3. הוסף 1 μL tBHP תמיסת מלאי בבארות המתאימות כדי לקבל ריכוז סופי של 200 μM.
4. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
5. הוסף 1 μL לכל באר של דילול 1.25 mM של הבדיקה פלואורוגנית כדי לקבל ריכוז סופי של 5 μM.
6. הוסף 1 μL לכל באר של דילול 1.25 מ"ג / מ"ל של Hoechst כדי לקבל ריכוז סופי של 5 מיקרוגרם / מ"ל.
7. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
8. הסר את המדיום מבלי להפריע ל- BMM. בעדינות, להוסיף 250μL של DMEM חם ללא פנול אדום.
   הערה: אם מתוכננת רכישה לטווח ארוך, הוסף תרכובות גורמי גדילה ל- DMEM ללא אדום פנול.
9. דמיינו את האורגנואידים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בתא תרמי ובאספקת גז המזהה את הבדיקה הפלואורוגנית (ROS).
   הערה: העירור/פליטה (ex/em) עבור הבדיקה הפלואורוגנית הוא 644/665, ex/em עבור Hoechst (גרעינים) הוא 361/486, ו-ex/em עבור GFP (תאי גזע מעי מעכברי Lgr5-GFP) הוא 488/510. מטרת טבילת שמן 63x משמשת לזיהוי אותות בתאי גזע. אין לשנות את הגדרות הלייזר בין דגימות. ניתן להשתמש במטרה של פי 20 כדי לאפשר סקירה כללית של ייצור ROS.
10. השתמש בבקרה החיובית כדי להגדיר עוצמת לייזר וזמן חשיפה עבור אות ROS ובדוק שאות זה נמוך יותר בבקרה השלילית.
11. באמצעות העינית, סנן את השקופית כדי לזהות את אורגנואידי GFP המבטאים ולהתאים את עוצמת הלייזר.
    הערה: שלב זה מבוצע באופן ידני.
12. הגדר מיקומים לקבלת תמונה תפורה של האורגנואיד כולו. הגדר ערימת z של 25 מיקרומטר (גודל צעד 5 מיקרומטר) כדי לקבל קטע של האורגנואידים המציג שכבה אחת של תאים.
    הערה: עיין במדריך למשתמש במיקרוסקופ כדי לייעל את ההתקנה. באמצעות תאים חיים, הרכישה צריכה להיעשות בתוך 1 שעה לאחר סיום הדגירה.
13. פתח את התמונות בתוכנת עיבוד תמונה בקוד פתוח (ראה טבלת חומרים).
14. עבור על ערימת z ובחר את החלק שבו אמצע האורגנואידים מיוצג היטב וליצור תמונה חדשה עם האזור שנבחר.
15. כמת את התמונות לפי השלבים הבאים.
    1. בחר בכלי קו חופשי.
    2. צייר קו בעקבות הגרעינים.
       הערה: בחר רק אזורים המציגים תאים חיוביים ל- GFP אם רק תאי גזע מנותחים.
    3. הגדל את רוחב הקו כדי לכסות את שכבת התא בקו מבלי לכלול את הפסולת הלומינלית.
    4. בחר את הערוץ עבור אות ROS ומדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות באזור שנבחר והוסף ביאורים לערכים.
    5. צייר קו שבו אין אות ומדוד את עוצמת הפלואורסצנט של הרקע שתופחת מהערך הקודם כדי לקבל את העוצמה הסופית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
עכברים
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5- GFP)	מעבדת ג'קסון
מדיום תרבות צמיחה
DMEM F12 מתקדם (DMEM/F12)	תרמופישר	12634010
פניצילין-סטרפטומיצין (P/S)	תרמופישר	15140122	ריכוז במלאי: 100x (10,000 יחידות/מ"ל פניצילין ו-10,000 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין)
FLuoroBrite DMEM (DMEM ללא פנול אדום)	תרמופישר	A1896701
הוכסט 33342	תרמופישר	H3570	מלאי ב-10 מ"ג/מ"ל
גורם גדילה מטריג'ל מופחת, ללא פנול אדום (מטריצת קרום מרתף)	קורנינג	356231	לאחר הקבלה להפשיר o / n במקרר, לשמור 1 שעה על קרח, לעשות 500 מ"ל aliquots ולאחסן ב -20 ° C
μ-שקופית 8 תאי באר	איבידי	80826
N-אצטיל-ציסטאין (NAC)	סיגמא	A9165
תמיסת tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP) (70%wt. ב-H2O2)	סיגמא	458139
תוכניות וציוד
פיג'י/ImageJ			https://imagej.net/software/fiji/ הורדת תמונות
Observer.Z1	זיס		מערכת קונפוקלית
Opterra (קונפוקל שדה נסחף)	ברוקר		מערכת קונפוקלית
מצלמת EMCCD במהירות גבוהה Evolve Delta 512	פוטומטריה		מערכת קונפוקלית
פריזמה	תוכנת GraphPad		ניתוח סטטיסטי