כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת ריאגנטים וחומרים לגידול אורגנואידים במעיים
- כדי להכין מדיום תרבית גדילה, ערבבו DMEM/F-12 מתקדם בתוספת 1x גלוטמין, 1x תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין (P/S), 10 מילימול HEPES, 50 ננוגרם/מ"ל של מורין EGF, 20 מיקרוגרם/מ"ל של מורין נוגין 500 נ"ג/מ"ל עכבר R-ספונדין1 (ראו טבלת חומרים). השאירו את המדיום בטמפרטורת החדר (RT) במהלך חילוץ הקריפטה.
הערה: מקפיאים את המדיום שאינו בשימוש ב aliquots ב -20 °C. יש להימנע מהקפאה והפשרה.
- מלא צינור 50 מ"ל עם 40 מ"ל של DMEM/F-12 מתקדם ושמור אותו על ice.
הערה: שמור את המדיום שאינו בשימוש על 4 ° C. הוא ישמש למעבר אורגנואידים.
- מחממים מראש את צלחות תרבית התאים (96 - תחתית עגולה היטב) באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.
- הפשרת מטריצת קרום מרתף (BMM) (ראה טבלת חומרים) aliquots על קרח (לפני תחילת הפרוטוקול או לפחות 1 שעה לפני ציפוי crypts).
הערה: ה-BMM יתמצק במהירות אם לא יישמר קר.
- הכינו תמיסת שטיפה/שטיפה על ידי הוספת תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין 1% ל-DPBS (DPBS-P/S).
- מלאו צלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ ב-10 מ"ל של DPBS-P/S קרים. מלאו שישה צינורות 15 מ"ל ב-10 מ"ל DPBS ותייגו אותם מ-F1 עד F6.
- הכן 30 מ"ל של תמיסת EDTA 10 mM על ידי דילול מ 0.5 M EDTA ב- DPBS. מלא שני צינורות 15 מ"ל עם 10 מ"ל של 10 mM EDTA, ותייג אותם E1 ו- E2.
- יש לשמור את כל התמיסות מקוררות מראש בטמפרטורה של 4°C ולשמור אותן על הקרח במהלך ההליך.
2. תרבית אורגנואידים במעיים
- הקריבו עכבר Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) בן 8-10 שבועות בהתאם לכללים ולתקנות הלאומיים.
- אספו 5-8 ס"מ מהג'ג'ונום המקיף את האזור שבין התריסריון (5 ס"מ מהקיבה) לבין האילאום (10 ס"מ מהצקום) ושמרו ב-DPBS-P/S קר על קרח.
- נקה את תוכן המעי על ידי שטיפה עם 5-10 מ"ל של DPBS-P / S.
קר
הערה: מזרקי שטיפה תוצרת בית ניתן להשיג על ידי חיבור קצה 200 μL על זרבובית מזרק 10 מ"ל.
- פתחו את המעי לאורכו באמצעות מספריים כדוריים (ראו טבלת חומרים) (למניעת פגיעה ברקמה).
- בעזרת מלקחיים, מעבירים את הרקמה לצלחת פטרי המכילה DPBS-P/S קר בטמפרטורת החדר ומנערים אותה לשטיפה.
- עם פיפטה פסטר פלסטיק, לתפוס את המעי על ידי שאיפה ולהעביר אותו לתוך צינור 15 מ"ל שכותרתו E1 המכיל 10 מ"ל קר 10 mM EDTA.
- הופכים את הצינור 3 פעמים ודגורים על קרח במשך 10 דקות.
- באמצעות פיפטה פסטר פלסטיק, להעביר את הרקמה בצינור F1 המכיל 10 מ"ל DPBS. מערבולת במשך 2 דקות (על מערבולת רגילה, מחזיק את הצינור ביד ומוודא שהמעי מסתחרר יפה).
- שים 10 μL של השבר בצלחת פטרי ולהעריך את איכות השבר תחת מיקרוסקופ.
הערה: כל שלבי המערבולת מבוצעים במהירות מרבית, ויש להעריך את איכותו של כל שבר תחת המיקרוסקופ (איור 1).
- עם פיפטה פסטר פלסטיק, לתפוס את המעי על ידי שאיפה ולהעביר אותו בצינור F2 המכיל 10 מ"ל DPBS ומערבולת במשך 2 דקות.
- חזור על שלב 2.10, העברת הרקמה בצינור F3 המכיל 10 מ"ל DPBS ומערבולת במשך 2 דקות.
- חזור על דגירה EDTA כמו בשלב 2.6, העברת הרקמה בצינור E2 המכיל 10 mM EDTA.
- הופכים את הצינור 3 פעמים ודגרים על קרח במשך 5 דקות.
- חזור על שלב 2.10, העברת הרקמה בצינור F4 המכיל 10 מ"ל DPBS ומערבולת במשך 3 דקות.
- חזור על שלב 2.14, העברת הרקמה בצינור F5 המכיל 10 מ"ל DPBS ומערבולת במשך 3 דקות.
- חזור על שלב 2.15, העברת הרקמה בצינור F6 המכיל 10 מ"ל DPBS ומערבולת במשך 3 דקות.
- שלב את סינון השברים הטוב ביותר על ידי כוח הכבידה דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מ"ל (על קרח) כדי לסלק וילי ופסולת משמעותית.
הערה: בדרך כלל, F5 ו- F6 הם השברים המכילים קריפטות רבות ופחות פסולת.
- סובב את הקריפטות ב 150 x גרם ב 4 ° C במשך 3 דקות.
- רוקן את הצינור, שבש את הגלולה באופן מכני והוסף 5 מ"ל של DMEM/F12 קר.
- שים 10 μL של ההשעיה בצלחת פטרי ולספור את מספר crypts נוכח aliquot באופן ידני תחת מיקרוסקופ.
הערה: אין לספור תאים בודדים או פסולת קטנה.
- חשב את נפח (V) של תרחיף הקריפטות הנדרש ב- μL, בהתחשב בכך ש- 300 קריפטות מצופות לכל באר, W הוא מספר הבארות, ו- N הוא מספר הקריפטות הנספרות מתוך 10 μL של התרחיף. העבר את הקריפטים לצינור חדש של 15 מ"ל.
הערה: V = 300 x רוחב x 10/N. אם נעשה שימוש בנפח קטן בניסוי המתוכנן, ניתן להשתמש בצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
- סובב את הקריפטות ב 200 x גרם ב 4 ° C במשך 3 דקות.
- מוציאים בזהירות את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה.
- משבשים מכנית את הגלולה ומוסיפים בעדינות מדיום גידול כדי לקבל ריכוז של 90 crypts / μL.
- הוסף 2 כרכים של BMM לא מדולל כדי לקבל ריכוז סופי של 30 crypts / μL. בזהירות פיפטה למעלה ולמטה מבלי להכניס בועות אוויר לתוך התערובת.
הערה: שמור תמיד את הצינור על קרח כדי למנוע התמצקות BMM.
- צלחת 10 μL של crypts / BMM לערבב לתוך כל באר. לניתוח ציטומטריית זרימה, השתמש בלוחות עגולים בעלי 96 בארות. מפזרים 10 μL במרכז כל באר כיפה.
הערה: לוחית את האורגנואידים כשכבה דקה לבדיקת ההדמיה כדי לאפשר את ההדמיה המעמיקה שלהם.
- השאירו את הצלחת למשך 5 דקות ב-RT כדי לאפשר ל-BMM להתמצק. מניחים את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2 למשך 15 דקות.
- הוסף 250 μL של מדיום צמיחה לתוך כל באר, נזהר לא לנתק את BMM.
- מניחים את הצלחות באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2.
- בצע את ניתוח ROS בין ימים 4 ו 6 של תרבות. אחרת, שנו את המדיום ופצלו, האורגנואידים לאחר הופעתם של מספר מבנים ניצנים ארוכים וכאשר תאים מתים מצטברים בלומן של האורגנואידים.
3. אורגנואידים עוברים
- התחילו להעביר אורגנואידים במעי הדק מהיוםהשישי לתרבית, כאשר נוצרו מבנים ניצנים משמעותיים, והלומן של האורגנואידים הפך כהה.
הערה: לומן האורגנואיד הופך כהה עקב הצטברות של תאים מתים, פסולת וריר. הימנעו מלתת לאורגנואידים לגדול יתר על המידה לפני הפיצול. יחס הפיצול תלוי בגדילת האורגנואידים. מומלץ לעבור את האורגנואידים ביחס של 1:2 ביום 6 ו-1:3 ביום 10.
- מלא צינור 15 מ"ל עם 4 מ"ל של DMEM/F-12 מתקדם קר ושמור אותו על ice.
הערה: כאן, נפחים עבור צלחת תרבות 96 בארות מסופקים. אם נעשה שימוש בפורמט אחר, כוונן את עוצמת הקול בהתאם.
- בזהירות לשאוף את המדיום עם פיפטה או משאבת ואקום מן הבארות מבלי לגעת בכיפות BMM, ולהשליך אותו.
- יש להוסיף 100 μL של DMEM/F-12 מתקדם קר לכל באר. פיפטה למעלה ולמטה כדי לשבור את BMM ולהעביר את התוכן של הבאר לתוך צינור 15 מ"ל.
- לשטוף את הבאר עם 200 μL קר מתקדם DMEM/F-12 ולאסוף אותו באותו צינור.
הערה: אם מעבירים מספר בארות מאותו מצב ניסויי, ניתן לאגד את תכולת הבארות באותו צינור איסוף של 15 מ"ל.
- סובב את צינור האיסוף בנפח 15 מ"ל במהירות של 100 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C.
- השליכו את הסופרנאטנט והוסיפו 1 מ"ל של DMEM/F-12 מתקדם קר לכדור. באמצעות קצה P1000, קח קצה P10 (ללא פילטר) ופיפטה למעלה ולמטה לפחות 20 פעמים.
- הוסף 4 מ"ל של DMEM/F-12 מתקדם קר לצינור. סחור ב-300 x גרם במשך 5 דקות ב-4°C.
- שאפו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה או משאבת ואקום מבלי להפריע לכדורית. לאחר מכן, לשבש את הגלולה באופן מכני.
- הוסף BMM מדולל בתווך תרבית צמיחה (יחס 2:1). בזהירות פיפטה למעלה ולמטה מבלי להכניס בועות אוויר לתערובת.
- צלחת 10 μL של crypts / BMM לערבב לתוך כל באר.
- שמור את הצלחת למשך 5 דקות ב- RT כדי לאפשר ל- BMM להתמצק. מניחים את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2 למשך 15 דקות.
- הוסף 250 μL של מדיום גידול לכל באר.
הערה: היזהר לא לנתק את BMM.
- מניחים את הצלחות באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2.
4. הכנת ריאגנטים וחומרים להערכת עקה חמצונית באורגנואידים במעיים
- הכינו תמיסת מלאי של 250 מילימטר של מעכב N-אצטיל-ציסטאין (NAC) (ראו טבלת חומרים), והשהו מחדש 10 מ"ג עם 245 מיקרוליטר של DPBS. יש להשתמש בריכוז סופי של 1 mM.
- הכינו תמיסת מלאי של 50 mM של השראת Tert-butyl hydroperoxide (tBHP), 70% במים, ודללו 3.22 μL עם 496.8 μL של DPBS. יש להשתמש בריכוז סופי של 200 מיקרומטר.
- עבור מחקר הציטומטריה של זרימה, הכינו תמיסת עבודה של 250 מיקרומטר של בדיקה פלואורוגנית (ראו טבלת חומרים) על ידי דילול תמיסת המלאי 1/10 ב-DMSO. יש להשתמש בריכוז סופי של 1 מיקרומטר.
הערה: כפי שצוין בהוראות היצרן, הבדיקה הפלואורוגנית רגישה לאור ולחמצן. מניות ו aliquots לא צריך להיפתח ולסגור יותר מדי פעמים.
- הכן תמיסה סופית של 0.1 מיקרוגרם/מ"ל DAPI ב-DPBS, שתשמש לאפליה של תאים מתים בבדיקת הציטומטריה של זרימה.
הערה: שלבים אלה מתארים שימוש בבקרות שליליות וחיוביות שיש לכלול בכל בדיקה, תוך שימוש בתנאים המצוינים באיור 2A. הבדיקה יכולה לשמש לבדיקת תרכובות נוגדות חמצון או פרו-אוקסידנטים. השלבים זהים, וההבדל היחיד הוא כאשר מוסיפים את התרכובות לפני השימוש בצבע פלואורוגני.
5. כימות העקה החמצונית על האורגנואידים המנותקים באמצעות ציטומטר זרימה
- הוסף תמיסת מלאי NAC של 1 μL בבארות לבקרות שליליות לקבלת ריכוז סופי של 1 mM.
הערה: השתמשו באורגנואידים המצופים בלוחות בעלי 96 בארות בעלות תחתית עגולה.
- יש לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
- הוסף 1 μL tBHP תמיסת מלאי בבארות המתאימות כדי לקבל ריכוז סופי של 200 μM.
- יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
- עם פיפטה רב ערוצית, להסיר את המדיום מבלי להפריע BMM מחובר ולהעביר אותו עוד 96 צלחת תחתונה עגולה היטב. שומרים את הצלחת בצד.
- הוסף 100 μL של טריפסין, ועם פיפטה רב ערוצית, פיפטה למעלה ולמטה לפחות חמש פעמים כדי להרוס את BMM.
- יש לדגור לא יותר מ-5 דקות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
- עם פיפטה רב ערוצית, פיפטה למעלה ולמטה לפחות חמש פעמים כדי לנתק את האורגנואידים.
- סובב ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב- RT.
- השליכו את הסופרנאטנט על ידי היפוך הצלחת. הוסף בחזרה את המדיום שנאסף בשלב 6.3 לבארות המתאימות והשהה מחדש את התאים על ידי צנרת למעלה ולמטה 5 פעמים.
- הוסף את הבדיקה הפלואורוגנית בריכוז הסופי של 1 μM. הוסף 1 μL לכל באר מהדילול של 250 μM ודגור במשך 30 דקות ב- 37 ° C ו- 5% CO2.
הערה: אל תוסיפו את הגשושית הפלואורוגנית לבארות הדרושות להגדרות המכשיר (איור 2B).
- סובב ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב- RT.
- השהה מחדש את התאים עם 250 μL של תמיסת DAPI של 0.1 מיקרוגרם/מ"ל. העבר את הדגימות בצינורות ציטומטריית הזרימה המתאימים, שמור את הצינורות על קרח והמשך בניתוח.
הערה: הוסיפו PBS במקום DAPI לבארות הדרושות להגדרות המכשיר (איור 2B).
- מטב את הגדרות מתח הפיזור קדימה וצידית בבקרה לא מוכתמת ובמתחי לייזר עבור כל פלואורופור באמצעות דגימות מוכתמות מונו.
- באמצעות אסטרטגיית gating מתאימה (איור 3A), אספו לפחות 20,000 אירועים.
הערה: עדיפות ל-50,000 אירועים. הגדרות רכישה מפורטות משתנות בהתאם למכשיר שבו נעשה שימוש.
