בדיקת SUMOylation: טכניקה במבחנה לזיהוי מצב SUMOylation של חלבוני סובסטרט על ידי immunoblotting

תקציר

מקור: Yang, W. S. et al., In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את שיטת in vitro עבור SUMOylation של חלבוני סובסטרט באמצעות מפל אנזימים רציף. יתר על כן, מצב SUMOylated של החלבון מזוהה באמצעות אלקטרופורזה וטכניקת immunoblotting.

פרוטוקול

1. הכנת מבני ביטוי Baculovirus

1. לטהר את SUMO E3 ligase K-bZIP על ידי שיבוט cDNA של K-bZIP לווקטור baculovirus בעל ביטוי כפול (ראה טבלת חומרים) עם תג אפיטופ N-terminal. הייתה לנו הצלחה בשימוש בתג octapeptide (מצוין לאורך כל הפרוטוקול כ- vector-tag-K-bZIP).
   הערה: תבנית ה-DNA לשיבוט תגובת שרשרת K-bZIP פולימראז (PCR) היא cDNA המשועתק לאחור מ-RNA שבודד מתאי TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 לאחר טיפול בדוקסיציקלין.
   1. העבר את cDNA K-bZIP באורך מלא לווקטור הביטוי הכפול עם אתרי שיבוט CpoI. CPOאני מעכל את מכפלת ה-PCR ו-1 מיקרוגרם של וקטור הביטוי הכפול ב-37°C למשך 3 שעות.
   2. יש להפריד ולחלץ את הדנ"א המעוכל בעקבות אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז 0.8%. קשרו את האינסרט (K-bZIP) ואת הווקטור על ידי T4 DNA ליגאז ב-16°C למשך 30 דקות בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים).
   3. הוסף 5 μL של DNA קשירה ל 50 μL תאי E. coli מוכשרים "A" (ראה טבלת חומרים) בצינור 1.5 מ"ל. לשים על קרח במשך 30 דקות. לאחר מכן, לדגור את הצינור 1.5 מ"ל באמבט מים 42 מעלות צלזיוס במשך 45 שניות ומיד לשים את הצינור על קרח במשך 3 דקות.
   4. הוסף 600 μL S.O.C. בינוני (0.5% (w/v) תמצית שמרים, 2% (w / v) טריפטון, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 20 mM MgSO₄, ו 4% (w / v גלוקוז) לתוך הצינור לדגור ב 37 ° C במשך 1 שעות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות ב 600 x גרם.
   5. יש להסיר את הסופר-נטנטנט, להשהות מחדש את הגלולה עם 60 μL Luria-Bertani medium (LB; 1% (w/v) טריפטון, 0.5% (w/v) תמצית שמרים ו-85 mM NaCl) ולמרוח על צלחות אגר LB המכילות 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין. לדגור על צלחת אגר ב 37 ° C במשך 16 שעות.
   6. בחר מושבה אחת לחיסון בתווך 5 מ"ל LB המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין ותרבית ב 37 ° C במשך 16 שעות עם 250 סל"ד רועד. לאחר מכן, חלצו את הפלסמיד, וקטור-תג-K-bZIP, על ידי ערכת מיצוי פלסמיד בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
2. צור את הבקמיד הרקומביננטי המכיל את התג-K-bZIP על ידי הפיכת הווקטור-תג-K-bZIP לתאי E. coli מוכשרים "B" (ראה טבלת חומרים).
   1. מערבבים 0.2 מיקרוגרם וקטור-תג-K-bZIP פלסמיד ו 100 μL מוכשר E. תאי קולי "B" בצינור 1.5 מ"ל ולשים על קרח במשך 30 דקות. לדגור את הצינור באמבט מים 42 מעלות צלזיוס במשך 45 שניות ומיד לשים את הצינור על קרח במשך 3 דקות.
   2. הוסף 900 μL של מדיום S.O.C. לתוך הצינור ודגר ב 37 ° C במשך 4 שעות עם סיבוב ב 50 סל"ד. לאחר מכן, קח 10 μL של המדיום, והוסף עוד 50 μL של מדיום S.O.C כדי להפיץ על לוחות אגר LB המכילים 50 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin, 7 מיקרוגרם / מ"ל gentamicin, 10 מיקרוגרם / מ"ל טטרציקלין, 100 מיקרוגרם / mL מצע גלקטוזידאז, ו 40 מיקרוגרם / מ"ל isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), ולדגור את הצלחות במשך 48 שעות ב 37 ° C.
   3. חסן מושבה לבנה אחת בתווך 5 מ"ל LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל קנמיצין, 7 מיקרוגרם / מ"ל גנטמיצין, ו 10 מיקרוגרם / מ"ל טטרציקלין. יש לדגור ב-37°C עם רעידות של 250 סל"ד במשך 16 שעות.
   4. בודדו את הדנ"א הבקמידי הרקומביננטי המכיל את התג-K-bZIP, כמתו והשהה מחדש בריכוז של 1 מיקרוגרם/μL.
3. צור baculoviruses רקומביננטי המבטא tag-K-bZIP על ידי הדבקה 1 מיקרוגרם של DNA bacmid רקומביננטי המכיל tag-K-bZIP לתוך תאי Sf9 בבאר אחת של צלחת 6 בארות.
   1. זרע 2 x 10⁶ תאי Sf9 (ראה טבלת חומרים) במדיום חרקים של 2 מ"ל גרייס המסופק עם 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% גנטמיצין בכל באר של צלחת בעלת 6 בארות, ולאחר מכן דוגרים בטמפרטורה של 27°C למשך שעה אחת.
   2. שמור על תרבית שלב יומן של תאי Sf9 בתווך החרקים של גרייס המסופק עם 10% FBS, 1% גנטמיצין ו-1% דטרגנט C (ראה טבלת חומרים) ב-27°C בתרחיף מסלולי ב-140 סל"ד. לספור תאים באמצעות hemocytometer ו tripan כחול צביעה; כדאיות התא צריכה לעלות על 95%. שמור על תאים באמצעות יחס תת-גידול של 1:3 כל 2-3 ימים (צפיפות מינימלית ~ 0.5 x 10⁶ תאים / מ"ל).
   3. הוסף 2 μL bacmid DNA (1 מיקרוגרם / μL) ו 98 μL מדיה מופחתת בסרום (ראה טבלה של חומרים) לתוך צינור 2 מ"ל. לאחר מכן, הוסף מגיב טרנספקציה 4 μL (ראה טבלה של חומרים) לצינור ולערבב היטב. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
   4. מוסיפים את תערובת הטרנספקציה הזו (104 μL) לכל באר, ודגרים ב 27 מעלות צלזיוס במשך 12-16 שעות.
   5. הסר את המדיה המותשת בשאיפה עדינה, והחלף ב-2 מ"ל של מדיום חרקים טרי של גרייס המסופק עם 10% FBS ו-1% גנטמיצין. תאי Sf9 נצמדים באופן רופף למשטח הצלחת ולא יופרעו בשאיפה עדינה.
4. לאסוף baculovirus רקומביננטי לאחר transfection ולהגביר baculovirus כדי להשיג מלאי titer גבוה (P1) לניסויים נוספים.
   1. 72 שעות לאחר שינוי התווך, מגרדים את תאי Sf9 באמצעות מרים תאים סטרילי, אוספים את הסופרנאטנט מכל באר בודדת בצינור של 1.5 מ"ל, ומערבלים במשך 10 שניות.
   2. צנטריפוגה ב 4 ° C למשך 3 דקות ב 150 x גרם. לאסוף supernatant כמו P0 baculovirus ו aliquot בצינורות 1.5 מ"ל (1 מ"ל baculovirus בכל צינור). יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C.
   3. זרע 1 x 10⁷ תאי Sf9 ב 10 מ"ל מדיום חרקים של גרייס מסופק עם 10% FBS ו 1% gentamicin בצלחת פטרי 10 ס"מ לדגור ב 27 ° C במשך 1 שעה.
   4. להגברה של בקולו-וירוסים רקומביננטיים המבטאים tag-K-bZIP, יש להוסיף 0.5 מ"ל P0 baculovirus לתאי Sf9 הזרעים ולדגור ב-27°C למשך 48 שעות.
   5. יש לאסוף סופרנאטנט בצורת P1 baculovirus בצינור של 15 מ"ל ולאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודש אחד.

2. טיהור K-bZIP

1. שמור על תרבית שלב יומן של תאי Sf9 בתווך החרקים של גרייס המסופק עם 10% FBS, 1% גנטמיצין ו-1% דטרגנט C ב-27°C בתרחיף מסלולי ב-140 סל"ד כמתואר בשלב 1.3.2.
2. ביום הטרנסדוקציה, הוסף 1 מ"ל של סופרנאטנט המכיל baculovirus (P1) לתוך 250 מ"ל של תאי Sf9 עם צפיפות של 2 x 10⁶ תאים / מ"ל.
3. לדגור על תאי Sf9 במשך 72 שעות ב-27°C על שייקר מסלולי, עם טלטול של 140 סל"ד, ואז לאסוף באמצעות צנטריפוגה ב-2,740 x גרם למשך 15 דקות ב-4°C.
4. יש להסיר את כדורי תאי הסופרנאטנט והליז ב-10 מ"ל חיץ ליזיס (20 מ"מ HEPES pH 7.9, 0.5 מ"ל NaCl, 1% חומר ניקוי A (ראו טבלת חומרים), 2% גליצרול, קוקטייל מעכב פרוטאז) ולסובב ב-50 סל"ד באמצעות מיקסר תלוי בטמפרטורה של 4°C למשך 30 דקות.
5. תא צנטריפוגה ליזט ב 15,000 x גרם במשך 15 דקות כדי לאסוף את supernatant.
6. כדי לטהר את tag-K-bZIP, יש לדגור על הליזטים של התא (10 מ"ל) עם 50 μL של חרוזים מגנטיים מתויגים בנוגדנים בצינורות פוליפרופילן של 14 מ"ל, ולסובב ב-50 סל"ד למשך 3 שעות ב-4°C באמצעות מערבל תרחיף. לאחר לכידת החלבון, גלולה את החרוזים ב 800 x גרם צנטריפוגה במשך 30 s ב 4 ° C. להסיר את רוב supernatant, להשעות מחדש את החרוזים בנפח שיורי של כ 1 מ"ל, ולהעביר צינור 1.5 מ"ל לשטיפה.
7. שטפו את החלבון שנלכד על ידי הנחת הצינור המכיל את החרוזים על מעמד מגנטי, והוציאו את הסופרנאטנט לאחר שהחרוזים המגנטיים נצמדו במלואם לצד הצינור.
8. שטפו את החרוזים עם חיץ ליזיס ארבע פעמים.
   1. הוסף חיץ ליזיס 1 מ"ל לצינורות 1.5 מ"ל, והפוך את הצינורות 10 פעמים. הניחו את הצינור בנפח 1.5 מ"ל על מעמד מגנטי והוציאו את הסופרנאטנט כמתואר בסעיף 2.7.
   2. חזור על השלב הקודם עוד 3 פעמים.
9. שטפו את החרוזים במי מלח חוצצי פוספט (PBS) פעם אחת.
   1. הוסף 1 מ"ל PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na₂HPO₄, 1.5 mM KH₂PO₄) לצינורות 1.5 מ"ל, והפוך את הצינורות 10 פעמים.
   2. שים את הצינור 1.5 מ"ל על מעמד מגנטי ולאחר מכן להסיר את supernatant.
10. Elute tag-K-bZIP חלבון מתוך חרוזים מגנטיים מתויגים נוגדנים על ידי הוספת 100 μL של 150 מיקרוגרם / מ"ל octapeptide מדולל PBS לתוך צינור 1.5 מ"ל. סובבו את הצינור למשך 10 דקות ב-50 סל"ד על ידי מיקסר תלוי בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הניחו את הצינור בחזרה על המעמד המגנטי ואספו את הסופרנאטנט המכיל K-bZIP בצינור נקי של 1.5 מ"ל.
11. נתח 1-5 μL חלבון מטוהר tag-K-bZIP על ידי SDS-PAGE ואחריו צביעה כחולה Coomassie. טען דגימות של 2 מיקרוגרם, 1 מיקרוגרם ו-0.5 מיקרוגרם של אלבומין בסרום בקר (BSA) על אותו ג'ל והשתמש בו לכימות עם תוכנת עיבוד תמונה, כמו ImageJ. הערך את ריכוז K-bZIP בהשוואה לתקני BSA.
12. K-bZIP מטוהר מוכן כעת לשימוש בכל מבחן SUMOylation. לדלל את K-bZIP ב PBS לריכוז סופי של 100 ng / μL ולאחסן aliquots קטנים ב -80 ° C.

3. בדיקת SUMOylation

1. הוסף 3 μL של 100 ng/μL של tag-K-bZIP מטוהר לתערובת האב של כל תגובת SUMOylation במבחנה. רכיבים בתערובת האב מכילים 1 μL חלבון buffer, 1x SUMOylation buffer, 0.5 μL p53 protein (0.5 mg/mL), 25 nM של E1 activating enzyme (מלאי conc.: 1 μM), 50 nM של אנזים מצומד E2 (מלאי conc.: 10 μM), ו 250 ננומטר כל אחד פפטידים SUMO (SUMO-1, SUMO-2, או SUMO-3; מלאי conc.: 5 μM) לנפח סופי של 17 μL.
2. יש לערבב את התוכן בעדינות ולדגור על התגובה בטמפרטורה של 30°C למשך 3 שעות. עצור את התגובה על-ידי הוספת 20 μL של 2x SDS-PAGE טוען buffer (100 mM Tris-HCL pH 6.8, 4% נתרן דודציל סולפט, 0.2% (w/v) ברומופנול כחול, 20% (v/v) גליצרול, ו 200 mM β-mercaptoethanol) ו denature הדגימות ב 95 ° C במשך 5 דקות.
3. יש להפריד דגימות ב-SDS-PAGE, להעביר את החלבונים המופרדים לקרום PVDF באמצעות מנגנון העברה אלקטרופורטי יבש למחצה, ולנתח על ידי כתם מערבי באמצעות נוגדן אנטי-p53.
   1. הגדר את מנגנון הג'ל וטען 20 μL של דגימה לתוך בארות ג'ל.
   2. הפעילו את הג'ל 10% בזרם קבוע במתח של 80 וולט למשך כ-120 דקות (עד שרצועת הצבע מגיעה לתחתית הג'ל). לאחר השלמת אלקטרופורזה, לכבות את אספקת החשמל.
   3. נתקו את מנגנון הג'ל ואת קסטות הג'ל כדי להוציא את הג'ל, וצפו את הג'ל לתוך מאגר העברה יבש למחצה (48 מ"מ Tris-HCl, 39 מ"מ גליצין, 20% מתנול) למשך 5 דקות.
   4. קח מיכל נוסף והשרה את קרום PVDF במתנול למשך דקה אחת. לאחר מכן, הוציאו PVDF ממתנול והכניסו למאגר העברה יבש למחצה. מסעירים בעדינות את הממברנה במשך 5 דקות.
   5. הסר את כיסוי הבטיחות של המנגנון האלקטרופורטי היבש למחצה.
   6. נייר סינון רטוב מראש, ומכינים כריך ג'ל על אנודת הפלטינה התחתונה באופן הבא: נייר סינון, קרום PVDF, ג'ל ונייר פילטר.
   7. אבטח צלחת קתודה וכיסוי בטיחות, ולאחר מכן הפעל כתם בזרם קבוע של 15 וולט למשך 90 דקות. כבה את ספק הכוח, נתק מכשיר יבש למחצה והוציא את קרום PVDF.
   8. חסום קרום PVDF עם חיץ חוסם (5% חלב ללא שומן במאגר TBST (137 mM NaCl2, 20 mM Tris-HCl, 0.1% דטרגנט B (ראה טבלת חומרים), pH 7.6)) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת עם טלטול 30 סל"ד על ידי שייקר מסלולי.
   9. הכלאה של קרום PVDF עם נוגדן אנטי-p53 מדולל (1:1,000) בחיץ חוסם למשך 12-16 שעות ב-4°C עם טלטול של 30 סל"ד באמצעות מערבל תלייה.
   10. מוציאים את קרום ה-PVDF לתוך מיכל ומכניסים ל-TBST. יש לשטוף את קרום PVDF עם TBST פעמיים נוספות.
   11. השרו את קרום PVDF ב-TBST למשך 30 דקות עם טלטול של 45 סל"ד באמצעות שייקר מסלולי.
   12. הכלאה של קרום PVDF עם נוגדן נגד ארנב מצומד עם חזרת פרוקסידאז (HRP) מדולל (1:4,000) בחיץ חוסם למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם ניעור 30 סל"ד באמצעות מיקסר תלייה.
   13. שטפו את קרום PVDF עם TBST 3 פעמים כמתואר בשלב 3.4.10.
   14. השרו את קרום ה-PVDF ב-TBST למשך 30 דקות עם טלטול של 45 סל"ד באמצעות מערבל תלייה. הסר TBST והוסף PBS כדי לשמר את קרום PVDF ב- 4 ° C למשך עד 12 שעות.
   15. ערבבו את המצע הכימילומינסנטי המשופר (מצע ECL) מגיב 1 ו-2 (1:1) (ראו טבלת חומרים). הסר את קרום PVDF מה- PBS, כתם לזמן קצר עם מגבת נייר או מגב קל כדי לספוג לחות עודפת, והוסף מיד 400 μL של מגיב ECL לפני השטח של כל ממברנה למשך 3-5 דקות. הסר מגיב ECL עודף על ידי ניקוי קצר, אבל לא לאפשר את הממברנה להתייבש לחלוטין.
   16. חשוף את הכתם באמצעות מערכת הדמיה של עוצמת האור או סרט צילום אוטורדיוגרפי
   .

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
pFastBac	Invitrogen	10359-016	ביטוי כפול וקטור baculovirus
וקטור pCR2.1-TOPO	Invitrogen		וקטור מוצר PCR
תא מוכשר E. coli DH5α	ביוטק שמרים	FYE678-80VL	תאי E. coli מוכשרים A
אי קולי DH10Bac	Invitrogen	10359-016	תאי E. coli מוכשרים B
FugeneHD	רוש	4709705001	מגיב טרנספקציה
Opti-MEM	גיבקו	31985062	מדיה מופחתת בסרום
T4 ליגאז	ניו אינגלנד BioLabs	M0202S
CpoI (RsrII)	תרמו סיינטיפיק	ER0741
בלו-גל	תרמו סיינטיפיק	B1690	מצע גלקטוזידאז
IPTG	סיגמא-אולדריץ'	I6758-1G
מדיום החרקים של גרייס	גיבקו	11605094
סרום בקר עוברי	גיבקו	10082147
גנטמיצין	תרמו פישר	15750060
אמפיצילין	סיגמא-אולדריץ'	A9393-25G
קנמיצין	סיגמא-אולדריץ'	K0254-20ML
גנטמיצין	גיבקו	15710-064
טטרציקלין	סיגמא-אולדריץ'	87128-25G
מרק LB	מרק	1.10285.0500
HEPES	סיגמא-אולדריץ'	H4034-100G
NaCl	סיגמא-אולדריץ'	S9888-5KG
KCl	מרק	1.04936.1000
נא2HPO4	סיגמא-אולדריץ'	S5136-500G
KH2PO4	ג'יי טי בייקר	3246-01
סודיום דודציל סולפט	מרק	1.13760.1000
β-מרקפטואתנול	ביו-ראד	161-0710
TRIS (בסיס)	ג'יי טי בייקר	4109-06
חלב דל שומן	פונטרה
גליצרול	ג'יי טי בייקר	2136-01
טריטון X-100	אמרסקו	0694-1L	חומר ניקוי A
טווין 20	אמרסקו	0777-500 מ"ל	חומר ניקוי B
פתרון Poloxamer 188	סיגמא-אולדריץ'	P5556-100ML	חומר ניקוי C
טבלית קוקטייל מעכב פרוטאז	רוש	04 693 132 001
3x פפטיד דגל	סיגמא	F4799
חרוזים מגנטיים נגד FLAG m2	סיגמא-אולדריץ'	M8823	חרוזים מגנטיים עם תיוג נוגדנים
ערכת SUMOlink SUMO-1	מוטיב פעיל	40120	פרוטוקול SUMOylation סטנדרטי
ערכת SUMOlink SUMO-2/3	מוטיב פעיל	40220	פרוטוקול SUMOylation סטנדרטי
ערכת מיצוי ג'ל QIAquick	קיאגן	28704
QIAGEN Plasmid מיני קיט	קיאגן	12123	ערכת מיצוי פלסמיד
צינורות פוליפרופילן	בז	352059
צלחת פטרי	בז	351029
מרים תאים	קורנינג	CNG3008
טיפ טעינה	סורנסון ביוסיינס	28480
PVDF	פרקיןאלמר	NEF1002
נייר סינון לניקוי	ביו-ראד	1703932
מנגנון ג'ל מיני לוח (Bio-Rad Mini Protean II Cell)	ביו-ראד	1658001 EDU
תא העברה אלקטרופורטי חצי יבש SD Trans-Blot	ביו-ראד	1703940
פירס ECL Western Blotting	תרמו	32106	מגיב ECL
מיקסר השעיה	מכשירי מעבדה של Digisystem Inc.	SM-3000
שייקר אורביטלי	Kansin כלי נגינה ושות'	OS701
ImageQuant LAS 4000	GE שירותי בריאות	28955810
הדמיה ביומולקולרית	GE שירותי בריאות	28955810
SF9	תרמו סיינטיפיק	B82501
נוגדן אנטי-P53	איתות סלולרי	#9282
נוגדן נגד ארנב	GE שירותי בריאות	NA934-1ML