מאמר שיטה

Fluorescence Microplate-Based Cycloheximide Chase Assay: טכניקה לניטור קינטיקה של פירוק חלבונים גרעיניים פלואורסצנטיים שאינם מקופלים כהלכה

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Guo, L. et. al., Assays for the degradation of misfolded proteins in cells. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מתאר בדיקת מיקרו-צלחות מבוססת פלואורסצנטיות במבחנה כדי לחקור את קינטיקה הפירוק של חלבון מוטנטי לוציפראז מקופל בצורה פלואורסצנטית המבוטא בגרעינים של תאי יונקים נגועים. הבדיקה כוללת טיפול בתאים המבטאים את החלבון המוטנטי הפלואורסצנטי עם מעכב תרגום ומעכב פרוטאזום כדי להעריך את הפירוק בתיווך פרוטאזום של החלבון המקופל בצורה שגויה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מגיב

  1. הכן מדיום DMEM בעל פלואורסצנטיות נמוכה לבדיקות באמצעות קורא פלואורסצנטי microplate. לערבב 25 מ"מ גלוקוז, 0.4 מ"מ גליצין, 0.4 מ"מ ארגינין, 0.2 מ"מ ציסטאין, 4.0 מ"מ גלוטמין, 0.2 מ"מ היסטידין, 0.8 מ"מ איזולאוצין, 0.8 מ"מ לאוצין, 0.8 מ"מ ליזין, 0.2 מ"מ מתיונין, 0.4 מ"מ פנילאלנין, 0.4 מ"מ סרין, 0.8 מ"מ תראונין, 0.078 מ"מ טריפטופן, 0.4 מ"מ טירוזין, 0.8 מ"מ ואלין, 1.8 מ"מ CaCl2, 0.81 מ"מ מ"ג4, 5.33 mM KCl, 44.0 mM NaHCO3, 110 mM NaCl, 0.9 mM NaH2PO4. התאם את ה- pH של התמיסה באמצעות HCl או NaOH ל- pH 7.4. לעקר את המדיום באמצעות סינון.
    הערה: מדיום זה מכיל רכיבים של מדיום DMEM סטנדרטי עם גלוקוז גבוה למעט Fe(NO3)3, ויטמינים, פנול אדום מושמטים. פנול אדום, ריבופלבין ופירידוקסל בתווך תרבית DMEM רגיל מפריעים באופן משמעותי לזיהוי אות פלואורסצנטי. מדיום תרבית ללא רכיבים אלה חיוני להדמיית GFP מוצלחת של תאים חיים. המדיום יציב במשך 12 חודשים כאשר מאוחסן בקירור.

2. בדיקת השפלה בזמן אמת של NLS-luciferase-GFP באמצעות קורא microplate פלואורסצנטי

  1. זרעו כ 1 x 104 תאי HeLa לתוך לוחות תרבית רקמה שחורים 96 באר עם תחתית שקופה. לאחר גידול O/N, מגיעים למפגש של 50-70% בזמן הטרנספקציה.
    הערה: 60 μl של תווך המכיל תאי HeLa מרחפים לחלוטין נזרעים ישירות לתוך כל באר. אין להוסיף צלחת בינונית או סלע נוספת קדימה ואחורה לאחר הזריעה, אחרת התאים עלולים להיות מפוזרים באופן לא אחיד.
  2. תאי HeLa מדביקים עם 0.05-0.1 מיקרוגרם של פלסמיד NLS-luciferase-GFP/pRK5 לכל באר באמצעות מגיב טרנספקציה על פי הוראות היצרן. הכינו תערובת טרנספקציה ראשית המכילה DNA ומגיב טרנספקציה והוסיפו אותה לכל באר. שלוש בארות עם תאים אינן נגועות בדנ"א, המשמש כבקרה לאות פלואורסצנטי רקע לכל תנאי טיפול.
    הערה: דרך חלופית להפחית את השונות בטרנספקציה היא להדביק תאים לפני הזריעה. עם זאת, חלק גדול מהתאים הנגועים בחלבונים שאינם מקופלים כהלכה אינם מצליחים להתחבר או להראות כדאיות מופחתת בשיטה זו. סביר להניח כי תאים מסוימים עשויים שלא לסבול את הלחץ הנגרם על ידי עיכול טריפסין כאשר מבטאים חלבונים רעילים שאינם מקופלים כראוי. כתוצאה מכך, האות הפלואורסצנטי הכולל מופחת באופן משמעותי.
  3. 20-24 שעות לאחר הטרנספקציה, בדקו את התאים החיים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך לביטוי GFP עם אורך גל עירור 450-490 ננומטר.
  4. הסר את המדיום על ידי שאיפת ואקום. הוסף כ 200 μl 1x PBS לכל באר ולאחר מכן לשאוף אותו להסיר כמות שיורית של מדיום DMEM.
  5. הוסף 60 μl של מדיום DMEM פלואורסצנטי נמוך עם 5% FBS ו- 50 מיקרוגרם / מ"ל CHX. כדי לבחון פירוק פרוטאזומלי, כלול מעכב פרוטאזום נוסף MG132 (10 מיקרומטר) בקבוצה אחת של דגימות. הגדר שלוש בארות לכל טיפול/מצב.
    הערה: טיפול MG132 נכלל כאמצעי בקרה לפירוק פרוטאזומלי מכיוון שחיוני לשלול גורמים אחרים שיכולים לגרום לנפילת אות פלואורסצנטי, כולל מוות תאי ומרווה פלואורסצנטית.
  6. מדוד את אות הפלואורסצנטיות של GFP באופן מיידי בקורא לוחות פלואורסצנטיים לאחר הוספת CHX.
    הערה: הגדרות מדידת התוכנה מוצגות בטבלה 1.
  7. קרא את הצלחת כל שעה עד 8-10 שעות. לאחר הקריאה, מחזירים את הצלחת לאינקובטור תרביות תאים.
  8. יצא את הנתונים כקובץ גיליון אלקטרוני. השתמש בערך ממוצע של קריאות מרובות עבור כל באר וכן בעוצמת פלואורסצנטיות. נרמול הערכים של כל נתונים, הצבע על הערכים הממוצעים של זמן 0 בקבוצות המתאימות. שרטטו את עוצמת הפלואורסצנטיות המנורמלת לאורך זמן כפי שמוצג באיור 1A ו-1B, ובאיור 2, בפאנלים הימניים.
  9. לבצע ניתוח סטטיסטי של שיעורי השפלה בין שני תנאים באמצעות ANOVA דו-כיווני עם מדדים חוזרים.
    הערה: בניתוח זה, "עוצמת פלואורסצנטיות" היא המשתנה התלוי, ואילו "תנאי טיפול" ו"זמן" הם שני הגורמים. במקום להשוות נתונים בנקודות זמן בודדות, ANOVA דו-כיווני עם מדדים חוזרים מנתח את ההבדל בין שתי קבוצות הטיפול לאורך כל מהלך הזמן.

טבלה 1: הגדרות מדידה בקורא מיקרו-לוחות פלואורסצנטיים.

Plate definition fileGRE96fb
מצב מדידהעוצמת פלואורסצנטיות תחתית
אורך גלאורך גל עירור485 ניוטון מטר
רוחב פס עירור9 נאנומטר
אורך גל פליטה535 ניוטון מטר
רוחב פס פליטה20 נאנומטר
מספר הבזקים5
רווחידני 200
זמן אינטגרציה20 מיקרוס
קריאות מרובות לכל בארסוגעיגול (מלא)
גודל5×5
גבול400 מיקרומטר

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1: בדיקה מבוססת מיקרו-צלחות פלואורסצנטיות עבור פירוק NLS-LucDM-GFP. תאי HeLa שנזרעו על 96 צלחות באר היו נגועים עם 0.05 מיקרוגרם (A) או 0.1 מיקרוגרם (B) NLS-LucDM-GFP וטופלו עם CHX בנוכחות או היעדר MG132. (א' ו-ב') עוצמות פלואורסצנטיות של בארות נמדדו בנקודות הזמן שצוינו (ערכים ממוצעים ± סטיות תקן, n = 3). הפאנלים משמאל מראים את ק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מדיום הנשר המותאם של דולבקולייף טכנולוגיות11995-092
סרום בקר עוברילייף טכנולוגיות10082147
ליפופקטמין 2000לייף טכנולוגיות11668019
MG132סיגמא-אולדריץ'M8699
חומצות אמינוסיגמא-אולדריץ'חומצות אמינו משמשות להכנת מדיום גידול פלואורצנטי נמוך
ציקלוהקסימידסיגמא-אולדריץ'C7698
אולימפוס IX-81 מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוךאולימפוסIX71/IX81
96 צלחת TC שחורה היטב עם תחתית שקופה שקופהסיגמא-גריינר89135-048
קורא לוח תחתון פלואורסצנטי Infinite 200® PROטקאןאינפיניטי 200® פרו
פריזמה 5GraphPadתוכנת ניתוח סטטיסטי

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

SUMOylationHeLa

מאמרים קשורים