מאמר שיטה

Bioreporter Assay: טכניקה רגישה באמצעות מערכת כתב Bioluminescent כדי לזהות נוגדנים SARS-CoV-2

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Rezaei, R. et al., Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter. J. Vis. Exp. (2021)

בסרטון זה, אנו מראים את הבדיקה מבוססת מערכת הדיווח הביולוגי HiBit-RBD לאיתור נוגדנים מנטרלים של SARS-CoV-2. מערכת זו מכוונת לתחום RBD הנגיפי באמצעות מערכת כתב ביולומינסנטית המכילה HiBiT המאוחה לתחום RBD.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. איתור נוגדנים נגד RBD עם בדיקה מהירה ורגישה

  1. בדיקת זיהוי נוגדנים HiBiT-RBD
    1. הכן את HiBiT-RBD bioreporter.
      הערה: מומלץ להשתמש בסופרנאטנט לבדיקה הבאה מכיוון שהוא פשוט יותר לאיסוף ומכיל את הגרסה המסוכררת הבוגרת של החלבון. יתר על כן, לליזט יש מספר חלבונים אחרים שעלולים להפריע לאינטראקציה HiBiT-RBD-נוגדנים.
    2. שלב 50 μL של סופרנאטנט המכיל HiBiT-RBD עם 1 מיקרוגרם של נוגדן מסחרי SARS-CoV-2-RBD במיקרו-צינורית של 1.5 מ"ל. הוסף 20 μL של חלבון קושר אימונוגלובולינים (חלבון G) לתמיסה. הגדל את הנפח הכולל ל- 300 μL על-ידי הוספת PBS.
      הערה: ניתן להקטין את הנפח הכולל של התערובת ל -150 μL. נפחים כוללים נמוכים יותר אינם מומלצים מכיוון שזה עלול לגרום לערבוב לא מספק של נוגדנים עם המדווח הביולוגי.
    3. יש לדגור על הצינור(ות) על שייקר או מסובב במשך 30 דקות. צנטריפוגה במהירות של 12,000 x גרם למשך 30 שניות, להשליך את הסופרנאטנט ולשטוף עם PBS. חזור על התהליך שלוש פעמים כדי להסיר HiBiT-RBD בחינם. השהה מחדש ב 50 μL של PBS ולהעביר צלחת 96 באר.
    4. הוסף 50 μL של 1x LgBiT והמתן 5 דקות. לאחר מכן, הוסף 50 μL של מצע NanoLuc 1x. קרא מיד את האות הזוהר עם לומינומטר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מכונת כביסה מגנטית ידנית Bio-Plexביו-ראד171020100מכשיר
מערכת בדיקת גלו-גלו-לוציפראזפרומגהE2940ערכה של 100 מ"ל
LGBiTפרומגהN3030ערכת בדיקה
פירס חלבון G חרוזים מגנטייםתרמו פישר סיינטיפיק88848בדיקת מעבדה
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) נוגדן מנטרל ספייק, עכבר Mabסינוביולוגי40592-MM57בדיקת מעבדה
Synergy Mx Microplate Readerביוטקלומנומטר קורא לוחות 96 בארות

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HiBiT RBDRBDProtein GLgBiT

מאמרים קשורים