בדיקת נוגדנים מנטרלים AAV מבוססת תאים: טכניקה קולורימטרית לזיהוי נוגדנים מנטרלים נגד וירוסים ספציפיים הקשורים באדנו בסרום

תקציר

מקור: Bass-Stringer, S., et al. שיטה שלב אחר שלב לזיהוי נוגדנים מנטרלים נגד AAV באמצעות בדיקה מבוססת תאים קולורימטריים. J. Vis. Exp. (2021)

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקה קולורימטרית במבחנה כדי לזהות נוכחות של נוגדנים מנטרלים כנגד וקטורים רקומביננטיים של סרוטיפ 6 (rAAV6) הקשורים לנגיף רקומביננטי המבטא פוספטאז בדגימות נסיוב כבשים. הבדיקה מנצלת את התגובה בין AAV המקודד גן phosphatase אלקליין שליה אנושי לבין המצע שלו כדי ליצור מוצר סגול בלתי מסיס.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

סקירה סכמטית של פרוטוקול הבדיקה מוצגת באיור 1.

1. הכנה ראשונית

1. להערכה בכבשים: יש לאסוף דם בצינורות מפריד קריש דם בנפח 8 מ"ל בסרום (ראו טבלת חומרים), להשאיר את דגימת הדם בטמפרטורת החדר (RT) למשך 20-30 דקות, ולאחר מכן לסובב מטה ב-2,100 x גרם למשך 15 דקות. הסופרנאטנט השקוף שנוצר בחלק העליון של הצינורות הוא סרום. Aliquot את הפאזה המימית השקופה לתוך צינורות microcentrifuge ולאחסן ב -80 °C.
   הערה: הסרום ב -80 ° C נשאר יציב במשך ~ 5 שנים. הדם נאסף מווריד התרדמה באמצעות מחט 16 גרם (חיתוך קצה) ומזרק מבעלי חיים בהכרה.
2. יש לחמם סרום בקר עוברי מומת (FBS) על ידי הכנסתו לאמבט מים בטמפרטורה של 56°C למשך 30 דקות, ולהסתחרר לסירוגין. לדיוק, הניחו מדחום בבקבוק שני המכיל נפח שווה ערך של מים והוסיפו אותו לאמבט החום במקביל לבקבוק FBS. התחל תזמון כאשר המדחום מגיע 56 °C (75 °F).
3. השתמש בטכניקה אספטית נכונה ובתרגול תרבית תאים עבור כל השלבים הבאים המבוצעים במכסה המנוע של תרבית התא. יש לרסס 70% אתנול על כל החפצים ועל מכסה המנוע לפני השימוש ולנקות עם 1% נתרן היפוכלוריט בסיום.
4. השלם את מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) על ידי שילוב גלוקוז גבוה (4.5 גרם / ליטר) DMEM (89%) עם FBS מומת חום (10%) וסטרפטומיצין פניצילין (1%). ערבבו וסננו באמצעות מערכת סינון ואקום סטרילית (גודל נקבוביות 0.22 מיקרומטר, קרום פוליאתרסולפון) (ראו טבלת חומרים). יש לאחסן DMEM שלם עטוף בנייר כסף ב-4°C.
5. הקמת תאי HT1080 (ראה טבלת חומרים) ומעבר בצלוחית מרובעת^{בגודל 75} ס"מ. צור מאגרים מוקפאים מרובים של תאים. אין להשתמש בתאים לאחר 20 מעברים מכיוון שמעבר נוסף עלול להשפיע על תוצאות הבדיקה.

2. יום 1 - ציפוי תאים

1. מעבר תאי HT1080 כאשר הם מגיעים ~ 80% מפגש.
2. DMEM מלא טרום חם (מוכן בשלב 1.4), 0.05% טריפסין-EDTA, ו 1x פוספט חוצץ מלוחים (PBS) עד 37 ° C באמבט מים. הסר את מדיום הגידול מתאים שעברו באמצעות מערכת שאיפה.
   הערה: כל השאיפות בפרוטוקול זה משתמשות במערכת ואקום עם צינור המחובר לפיפטה סרולוגית סטרילית של 5 מ"ל.
3. שטפו את התאים ב-10 מ"ל של 1x PBS שחומם מראש (37°C) וטריפסיניזציה של תאים למשך 3-4 דקות ב-4 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA שחומם מראש כדי לנתק את התאים מהבקבוק.
4. נטרל את הטריפסין על ידי הוספת 6 מ"ל של DMEM מלא שחומם מראש ופיפטה את התאים לתוך צינור 50 מ"ל. חשב את המספר והריכוז של תאים קיימא באמצעות hemocytometer ואת שיטת הדרה כחול trypan.
5. לדלל את התאים לריכוז של 1 x 10⁵ תאים / מ"ל ב DMEM מלא שחומם מראש. זרעו 100 μL של תאים/באר לתוך לוחות שטוחים שקופים בעלי 96 בארות שטוחות (1 x 10⁴ תאים לכל באר). לדגור על הצלחת ב 37 ° C, 5% פחמן דו חמצני (CO₂) במשך לילה במשך 16-22 שעות.

3. יום 2 - הדבקת התאים

1. הסר לוחות / ים מן האינקובטור ולהשתמש במיקרוסקופ אור כדי לאשר כי התאים מפוזרים באופן שווה בתוך הבארות וכי המפגש הוא ~ 50%. אם התאים אינם בטווח של 45%-55% מפגש, חזרו על פרוטוקול 'יום 1' והתאימו את ריכוז התאים הראשוני בהתאם.
2. צור דילולים סדרתיים של דגימות הסרום המעניינות בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל באמצעות DMEM מלא שחומם מראש כמדלל. טבלה 1 מדגימה יצירת מפל דילול עבור דגימות משולשות.
   1. כדי לבצע את הבדיקה בטריפליקט, הכינו 7.5 x10⁶ גנומים וקטוריים (vg)/μL של תמיסת עבודה של AAV6-hPLAP (ראו טבלת חומרים) על ידי דילול תמיסת מלאי וירוסים ב-1x PBS.
   2. הוסף 66 μL של תמיסת עבודה וירוס 7.5 x 10⁶ vg/μL לכל צינור המכיל 264 μL של דילול סרום/מדיה (330 μL של נפח/דילול כולל, ראה טבלה 1).
      הערה: זהו מבחן חזק שאינו דורש תנאי תרבות מושלמים. עם זאת, כדי לכמת במדויק ולהבטיח שכל הרצת בדיקה אמינה, יש לכלול את הדברים הבאים: (1) בקרת וירוסים ומדיה בלבד, (2) בקרת מדיה בלבד, ו-(3) דגימת בקרה חיובית NAb על כל הלוחות באותם תנאי ניסוי. הנפח המתואר (330 μL) מהווה דגימות משולשות + 10% מתערובת הסרום והנגיף. ביצוע שכפולים מומלץ מאוד לקביעה מדויקת של פעילות נטרול.
3. ערבבו את דילול הנגיף/סרום על ידי פיפטינג והניחו את הצינורות המכילים את תערובות הנגיף/סרום באינקובטור בטמפרטורה של 37°C, 5% CO₂ למשך 30 דקות כדי לאפשר נטרול פוטנציאלי
.
4. פיפטה 100 μL של תערובת וירוס/סרום לכל באר על צלחת 96 באר המכילה 1 x 10⁴ תאים/באר עבור כל דילול.
   הערה: זה ייצור ריכוז נגיפי סופי של 15k וירוסים / ריבוי תאים של זיהום (MOI) בכל באר. טבלה 2 מספקת דוגמה לפריסת לוחות מדגם של 96 בארות להערכת דגימות לדילול של 1/512.
5. עטפו את הצלחת בת 96 הבארות המכילה תאים, סרום ו-AAV-hPLAP בנייר כסף והניחו באינקובטור בטמפרטורה של 37°C, 5% CO₂ למשך הלילה למשך 16-24 שעות כדי לאפשר כניסת AAV לתאים.

4. יום 3 - תיקון והוספת מצע לתאים

1. מראש לחמם aliquot של 1x PBS ל 37 ° C (~ 25 מ"ל / צלחת 96 באר). מצננים אליציטוטים נפרדים של PBS (~ 25 מ"ל / צלחת 96 באר) ו- H₂O מזוקק כפול (DDW, ~ 25 מ"ל / צלחת 96 באר) ל -4 ° C. ממיסים גלולה של BCIP / NBT (ראה טבלת חומרים) ב 10 מ"ל של DDW בצינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל על ידי מערבולות (10 מ"ל מספיק עבור 2 x 96 לוחות באר).
2. שאפו את המדיה מהבארות של צלחת 96 הקידוחים באמצעות פיפטה סרולוגית או דומה המחוברת למערכת שאיפה מבוססת יניקה או שואב אדים של מכסה המנוע. מניחים בעדינות את קצה הפיפטה הסרולוגית לתוך הבאר ומסירים את המדיה תוך זהירות שלא להפריע לתאים המודבקים.
   1. הוסף 50 μL של RT 4% PFA לכל באר באמצעות פיפטה. עטפו את הצלחת בנייר כסף והשאירו אותה ב- RT למשך 10 דקות כדי לתקן את התאים.
      זהירות: Paraformaldehyde (PFA) הוא מסרטן סביר והוא רעיל ממגע עור או עין או שאיפה. יש לטפל במכסה מנוע עם ציוד מגן אישי מתאים, כמו גם מסכת פנים. הפוך 4% PFA טרי מדולל PBS (~ 7 מ"ל נדרש לכל צלחת 96 באר).
3. לשטוף ולשאוף את התאים עם 200 μL של RT 1x PBS. חזור על שלב זה פעמיים.
   הערה: פיפטה רב ערוצית היא אופציה יעילה לשלבי הפיפטציה.
4. פיפטה 200 μL של PBS שחומם מראש לתוך כל באר, לעטוף את הצלחת בנייר כסף, ולדגור ב 65 ° C במשך 90 דקות כדי denature פעילות phosphatase אלקליין אנדוגני.
5. לשאוף בארות ולשטוף תאים עם 200 μL של קר (4 ° C) PBS. לשאוף שוב, לשטוף 200 μl של DDW קר, ולשאוף שוב.
6. פיפטה 50 μL של BCIP/NBT מומס (מוכן בשלב 4.1) לתוך כל באר.
7. עוטפים את הצלחת בנייר כסף ודגרים ב-RT למשך 2-24 שעות
   הערה: להיות עקבי עם זמן הדגירה בין ריצות; גמישות הזמן מאפשרת למשתמשים לצלם בארות ביום השלישי או למחרת.
8. באמצעות מצלמת מיקרוסקופ אור, צלם תמונות של כל באר באמצעות עדשה אובייקטיבית 4x, וודא שנעשה שימוש עקבי באותה חשיפה, איזון לבן והגדרות אור עבור כל הבדיקות שבוצעו.
   1. מקמו כל באר באופן זהה וודאו ששולי הבאר אינם נראים בתמונות. שמור תמונות בפורמט TIF או דומה.
      הערה: הגדרות ספציפיות ישתנו בין מיקרוסקופים, אולם הכימות יהיה היעיל ביותר אם תאורת הרקע גבוהה ועקבית בכל הבארות (איור 1B).

טבלה 1: נפחים של סרום ודילול הדרושים ליצירת דילולים סדרתיים של סרום במשולש.

תווית מפל דילול	דילול	3 x דגימה (240 μL) + נפח חיץ 10% (24 μL)	יחס של סרום:מדיה
דילול 1 (D1)	1/2	264 μL סרום 264 μL מדיה	50:50
דילול 2 (D2)	1/4	264 μL D1 + 264 μL מדיה	25:75
דילול 3 (D3)	1/8	264 μL D2 +264μL מדיה	12.5:87.5
דילול 4 (D4)	1/16	264 μL D3 +264 μL מדיה	6.25:93.75
דילול 5 (D5)	1/32	264 μL D4 +264 μL מדיה	3.13:96.87
דילול 6 (D6)	1/64	264 μL D5 +264 μL מדיה	1.56:98.44
דילול 7 (D7)	1/128	264 μL D5 +264 μL מדיה	0.78:99.22
דילול 8 (D8)	1/256	264 μL D5 +264 μL מדיה	0.39:99.61
דילול 9 (D9)	1/512	264 μL D7 + 264 μL מדיה	0.2:99.8
דילול 10 (D10)	1/2048	132 μL D8 + 396 μL מדיה	0.05:99.95
דילול 11 (D11)	1/8192	132 μL D9 + 396 μL מדיה	0.01:99.99
דילול 12 (D12)	1/32768	132 μL D10 + 396 μL מדיה	0.003:99.997

טבלה 2: פריסת לוחות 96 בארות לדוגמה להערכת דגימות סרום נאיביות בדילול הנע בין 1/2 ל-1/512. דילולים גבוהים יותר משולבים בבדיקה אם מעריכים מדגם הידוע כחיובי עבור AAV NAbs (דגימות לאחר מתן משנה) או אם נדרש טיטר גבוה יותר. MO (-C): בקרת מדיה בלבד. VO (+C): בקרת וירוסים ומדיה בלבד. mAb: נוגדן חד שבטי נגד AAV (שליטה חיובית NAb).

דוגמת סרום #1

דוגמת סרום #2

דוגמת סרום #3

Mono AB (mAB), פקדים ודוגמאות נוספות

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

50 ng מ"ב

50 ng מ"ב

50 ng מ"ב

B

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

5 ng מ"ב

5 ng מ"ב

5 ng מ"ב

C

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

0.5 ng מ"ב

0.5 ng מ"ב

0.5 ng מ"ב

D

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

MO (-C)

MO (-C)

MO (-C)

E

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

VO (+C)

VO (+C)

VO (+C)

F

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

Sample #1 1/512

Sample #1 1/512

Sample #1 1/512

G

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

Sample #2 1/512

Sample #2 1/512

Sample #2 1/512

H

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

Sample #3 1/512

Sample #3 1/512

Sample >#3 1/512

תוצאות

איור 1: דיאגרמה סכמטית של פרוטוקול בדיקת NAb. (A) ייצוג חזותי של בדיקת NAb הממחיש את השלבים העיקריים הכרוכים בפרוטוקול שלושת הימים. בקצרה, תאים גדלים ומצופים בן לילה. למחרת, דילולים סדרתיים של הסרום מוכנים, מודגרים עם AAV, ולאחר מכן מודגרים עם התאים בן לילה. למחרת, התאים קבועים, נשטפים, מודגרים, משולבים עם המצע, ומודגרים שוב, ולאחר מכן הדמיה וכימות. (B) תמונות מייצגות של בקרת אות מינ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.05% טריפסין/EDTA	גיבקו	25300-054
50 מ"ל צינור צנטריפוגה חרוטי	בז	14-432-22	או שווה ערך
75 ס"מ2 צלוחיות מרובעות	בז	353136	או שווה ערך
96 צלחת תחתונה שטוחה היטב	בז	353072
וקטור AAV6-CMV-hPLAP			ניתן לספק מעבדה לחקר שרירים וטיפולים (אוניברסיטת מלבורן, אוסטרליה) AAV6-CMV-hPLAP על פי בקשה.
רדיד אלומיניום
נוגדן חד-שבטי לעכבר Anti-AAV6 (חלקיק שלם), (ADK6)	פרוגן	610159	שליטה חיובית נוגדן חד שבטי
BCIP/NBT	סיגמאפסט	B5655
ארון בטיחות לתרביות תאים ורקמות
פיפטה אלקטרונית			תוספות סטריפט 5 ו-10 מ"ל
סרום בקר עוברי	גיבקו	10099-141
המוציטומטר
גלוקוז גבוה Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	גיבקו	11965118
תאי HT1080	ATCC
אינקובטור			37°C, 5% CO2
מיקרוסקופ אור עם מצלמה			מסוגל לצלם תמונות עם עדשת 4x אובייקטיבית
תנור			לדגירת 65 מעלות צלזיוס
פרפורמאלדהיד	מרק	30525-89-4
אמבט מים
פניצילין סטרפטומיצין	גיבקו	15140-122