$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת מדיום גידול, תמיסת אופלוקסצין ומלאי תאי אי קולי
- מדיום לוריא-ברטאני רגיל (LB): הוסף 10 גרם/ליטר טריפטון, 10 גרם/ליטר נתרן כלורי (NaCl) ו-5 גרם/ליטר תמצית שמרים במים שעברו דה-יוניזציה (DI). לעקר את המדיום על ידי autoclaving.
- צלחות אגר LB: הוסף 10 גרם / ליטר של טריפטון, 10 גרם / ליטר של NaCl, 5 גרם / ליטר של תמצית שמרים, ו 15 גרם / ליטר אגר במי DI ולעקר את המדיום על ידי autoclaving. בטמפרטורה הרצויה (~ 55 ° C), יוצקים ~ 30 מ"ל של מדיום אגר לתוך לוחות מרובעים (10 x 10 ס"מ). יבשו את הצלחות ואחסנו אותן בטמפרטורה של 4°C.
- מדיום LB מעובד: הוסף 10 גרם/ליטר טריפטון ו-5 גרם/ליטר תמצית שמרים במי DI. לעקר את המדיום על ידי autoclaving.
- מדיום LB שונה כולל אוסמוליט: ערבב 2x מדיום LB שונה עם תמיסת אוסמוליט 2x בנפחים שווים. כדי להכין 2x LB מדיום שונה, להוסיף 20 גרם / ליטר של טריפטון ו 10 גרם / ליטר של תמצית שמרים במי DI ולעקר על ידי autoclaving. להכנת תמיסת אוסמוליט 2x, ממיסים את האוסמוליט הריבית (כמות פי 2) במי DI, ולאחר מכן מסננים את התמיסה.
הערה: ניתן לקבוע את האוסמוליט המעניין ואת ריכוזיו ממבחני הסינון של פנוטיפ מיקרו-מערך (ראה פרוטוקול 4). עם זאת, ניתן להתאים את האוסמוליט הנבדק ואת ריכוז 2x הקשור בהתאם לאופי המחקר. לדוגמה, כדי לחקור את ההשפעה של 1 mM נתרן כלורי, תמיסת אוסמוליט 2x תהיה תמיסת נתרן כלורי 2 mM.
- תמיסת ציר Ofloxacin (5 מ"ג/מ"ל): יש להוסיף 5 מ"ג מלח אופלוקסצין (OFX) ב-1 מ"ל מי DI. הוסף 10 μL של 10 M נתרן הידרוקסידי כדי להגדיל את המסיסות של OFX במים, ולאחר מכן לסנן לעקר את התמיסה. הכינו aliquots ולאחסן ב -20 °C.
הערה: Ofloxacin היא אנטיביוטיקה quinolone כי כבר בשימוש נרחב עבור תאים חיידקיים גדל ולא גדל14,21. הריכוז המעכב המינימלי (MIC) של OFX עבור תאי E. coli MG1655 הוא בטווח של 0.039-0.078 מיקרוגרם / מ"ל. כמו כן, שים לב כי אנטיביוטיקה אחרים כגון ampicillin ו kanamycin משמשים בדרך כלל במחקר מתמשך. הבחירה באנטיביוטיקה תלויה באופי המחקר.
- מלאי תאי E. coli MG1655: חסן 2 מ"ל של מדיום LB רגיל עם מושבה אחת במבחנה של 14 מ"ל (Snap-capped) ותגדל את התאים בשייקר אורביטלי ב 250 סל"ד ו 37 ° C. כאשר התאים מגיעים לשלב נייח, מערבבים 500 μL של תרבית התא עם 500 μL של 50% גליצרול (סטרילי) בבקבוקון קריוגני ומאחסנים ב -80 ° C.
2. התפשטות תאים לסילוק מתמידים קיימים
- כדי להכין תרבית לילה, יש לגרד כמות קטנה של תאים ממלאי תאים קפואים עם קצה פיפטה סטרילי (אין להפשיר את מלאי תאי הגליצרול), ולחסן את התאים ב-2 מ"ל של מדיום LB מעובד במבחנה של 14 מ"ל. תרבית את התאים בשייקר מסלול ב 250 סל"ד ו 37 ° C במשך 12 שעות.
- התפשטות ראשונה
- לאחר 12 שעות, העבירו 250 מיקרוליטר של תרבית לילה ל-25 מ"ל של מדיום LB טרי שעבר שינוי בבקבוק מבולבל של 250 מ"ל מכוסה ברדיד אלומיניום סטרילי.
- גדל את תרבית התאים בשייקר אורביטלי ב 250 סל"ד ו 37 ° C עד התאים מגיעים לשלב מעריכי אמצע (OD600 = 0.5).
- מדוד את הצפיפות האופטית ב- 600 ננומטר (OD600) באמצעות קורא מיקרו-לוחות כל 30 דקות.
- ריבוי שני
- ב OD600 = 0.5, לדלל 250 μL של תרבית תאים מן הבקבוק הראשון לתוך 25 מ"ל של מדיום LB שונה טרי בבקבוק 250 מ"ל מבולבל.
- גדל את תרבית התא השנייה בשייקר אורביטלי ב 250 סל"ד ו 37 ° C עד OD600 = 0.5.
- מדוד את הצפיפות האופטית כל 30 דקות.
הערה: בתרבית לילה עשויה להיות כמות משמעותית של תאים מתמידים. ניתן להשתמש בשיטת דילול/מחזור הצמיחה שתוארה לעיל כדי לסלק את המתמידים הקיימים לפני העברת התאים למיקרו-מערכים. ניתן לאמת את חיסולם על ידי כימות רמות קבועות יותר של תרביות לילה עם הבדיקה המתוארת בפרוטוקול 3.
3. אימות החיסול של תאים קבועים קיימים מראש
- לאחר ההתפשטות השנייה (ראה שלב 2.3), לדלל 250 μL של תרבית התא (OD600 = 0.5) ב 25 מ"ל של מדיום LB שונה טרי ב 250 מ"ל בקבוק מבולבל.
הערה: עבור בקרות, לדלל 250 μL של תרבית לילה (ראה שלב 2.1) ב 25 מ"ל של מדיום LB שונה טרי בבקבוק מבולבל 250 מ"ל. לפני העברת התאים לצלוחית, צפיפות התאים של תרבית הלילה צריכה להיות מותאמת בתווך LB שונה טרי כדי לקבל OD600 = 0.5.
- הוסף 25 μL של תמיסת מלאי OFX (5 מ"ג / מ"ל) לתרחיף התא ונער את הבקבוק בעדינות כדי להפוך את תרבית הבדיקה הומוגנית. הריכוז הסופי של OFX הוא 5 מיקרוגרם/מ"ל בתרבית הבדיקה.
- לדגור על תרבית הבדיקה בשייקר מסלול ב 250 סל"ד ו 37 ° C.
- בכל שעה במהלך הטיפול (כולל 0 שעות, נקודת הזמן לפני הוספת OFX לתרבית הבדיקה), להעביר 1 מ"ל של תרבית הבדיקה מן הבקבוק לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל.
- צנטריפוגה את תרבית הבדיקה בצינור מיקרוצנטריפוגה ב 17,000 x גרם במשך 3 דקות.
- בזהירות להסיר 950 μL של supernatant מבלי להפריע את גלולת התא.
- הוסף 950 μL של תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) לתוך צינור microcentrifuge.
- חזור על שלבי השטיפה 3.5-3.7 עבור 3x בסך הכל עד שריכוז האנטיביוטיקה יהיה מתחת לריכוז המעכב המינימלי (MIC).
- לאחר השטיפה הסופית, השהה מחדש את גלולת התא ב -100 מיקרוליטר של תמיסת PBS, וכתוצאה מכך דגימה מרוכזת פי 10.
- קח 10 μL של תרחיף התא ודלל אותו סדרתית שש פעמים בתמיסת PBS של 90 μL באמצעות צלחת תחתונה עגולה 96 באר
.
- נקודה 10 μL של תרחיפים תאים מדוללים על צלחות אגר טרי ללא אנטיביוטיקה. כדי להגדיל את גבול הזיהוי, צלחת את 90 μL הנותרים של תרחיף התא על צלחת אגר טרי.
- לדגור על לוחות אגר ב 37 ° C במשך 16 שעות, ולאחר מכן לספור את יחידות יצירת מושבה (CFUs). קח בחשבון את שיעורי הדילול תוך חישוב המספר הכולל של CFUs ב 1 מ"ל של תרבית בדיקה. עקומות הריגה נוצרות על ידי שרטוט ערכי CFU לוגריתמיים ביחס למשך הטיפול האנטיביוטי.
הערה: טיפול OFX של 6 שעות מספיק כדי להשיג עקומת הרג דו-פאזית עבור תאי E. coli. הרמה המתמשכת יותר של תאים מופצים (כפי שנמדדת על ידי ספירת CFU ב 6 שעות) צריכה להיות נמוכה משמעותית מזו של תרבית לילה. ההליכים המתוארים בפרוטוקולים 2 ו -3 יכולים להתבצע עם LB רגיל בהתאם לתכנון המחקר.
4. הקרנות לוחות Microarray
- הכנת תרביות תאי מיקרו-מערך
- העבר 250 μL של תאים בשלב מעריכי ל 25 מ"ל של מדיום LB שונה טרי בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל. ערבבו בעדינות את תרחיף התא כדי להפוך אותו להומוגני.
הערה: תאי הפאזה המעריכית (OD600 = 0.5) מתקבלים משלב ההתפשטות השני (ראה שלב 2.3).
- מעבירים את תרחיף התאים המדולל למאגר סטרילי של 50 מ"ל.
- באמצעות פיפטה רב ערוצית, להעביר 150 μL של תרחיף התא לכל באר של microarray, כלומר, צלחת 96 באר המכילה אוסמוליטים שונים.
הערה: בארות שאין בהן אוסמוליטים משמשות כבקרות.
- כסו את המיקרו-מערך בקרום איטום חדיר לגז.
- לדגור את הצלחת בשייקר מסלולית ב 37 ° C ו 250 סל"ד במשך 24 h.
הערה: בניסויים אלה נעשה שימוש בצלחות זמינות מסחרית, כגון מיקרו-מערכים של פנוטיפ (PM-9 ו-PM-10) הכוללים מגוון רחב של אוסמוליטים, מאגרי pH וכימיקלים אחרים במצב מיובש בריכוזים שונים. מיקרו-מערכים אלה נמצאים בחצי שטח 96 פורמטים של לוחות באר. יש להתאים את נפחי התרבית בהתאם לסוג הצלחות בהן משתמשים. מיקרו-מערכים יכולים להיווצר גם באופן ידני.
- הכנה ידנית של לוחות microarray
- העבר 75 μL של 2x תמיסות אוסמוליטים לתוך הבארות של צלחת באר 96 חצי שטח.
- העברת 500 μL של תאים בשלב מעריכי ל 25 מ"ל של 2x LB מדיום שונה בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל. ערבבו בעדינות את תרחיף התא כדי להפוך אותו להומוגני.
הערה: שיעור ההתחסנות הותאם כך שיהיה עקבי עם פרוטוקול בדיקת המיקרו-מערך המתואר ב-4.1.
- הוסף 75 μL של תרחיף התא לכל באר של חצי שטח צלחת 96 באר המכילה 2x תמיסות אוסמוליטים.
- לדגור את הצלחת בשייקר מסלולית ב 37 ° C ו 250 סל"ד במשך 24 שעות.
- הכנת צלחות בדיקה מתמידות
- הכינו 25 מ"ל של תווך LB שונה המכיל 5 מיקרוגרם / מ"ל של OFX בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל והעבירו תווך זה למאגר סטרילי.
- העבר 190 μL של מדיום LB שונה עם OFX מהמאגר לכל באר של צלחת באר גנרית שטוחה 96 (צלחת בדיקה מתמשכת) באמצעות פיפטה רב ערוצית.
- הסר את המיקרו-מערך מהשייקר (לאחר תרבית במשך 24 שעות) והעבר 10 μL של תרביות תאים מהמיקרו-מערך לבארות של צלחת הבדיקה המתמידה, המכילה מדיום LB שונה עם OFX.
- קח 10 μL של מתלי תאים מצלחת הבדיקה המתמידה, ודלל סדרתית שלוש פעמים בתמיסת PBS של 290 μL באמצעות צלחת 96 באר בעלת תחתית עגולה ופיפטה רב ערוצית.
- לאחר הדילול הסדרתי, יש לאתר 10 μL של כל מתלי התאים המדוללים סדרתית על לוחות אגר טריים ללא אנטיביוטיקה באמצעות פיפטה רב ערוצית.
- יש לדגור על הצלחת המתמשכת (שהוכנה בשלב 4.3.3) בשייקר אורביטלי בטמפרטורה של 37°C ו-250 סל"ד למשך 6 שעות לאחר כיסוי הצלחת בקרום איטום חדיר גז.
- לאחר 6 שעות דגירה בשייקר, הוציאו את צלחת הבדיקה המתמידה, וחזרו על השלבים 4.3.4-4.3.5.
- לדגור על צלחות אגר במשך 16 שעות ב 37 ° C, ולאחר מכן לספור CFUs. רמות CFU לפני ו 6 שעות אחרי הטיפול האנטיביוטי מאפשרים לחשב את החלק המתמיד בכל באר. ספירת CFU לפני הטיפול ב- OFX מסייעת גם להעריך את ההשפעות של אוסמוליטים ועל כדאיות E. coli.