1. מדידת הירידה בפרוטאוסטאזיס ברקמת השריר באמצעות בעלי חיים המבטאים פוליגלוטמין
הערה: ניתן להשתמש בשתי שיטות לזיהוי ירידה בפרוטאוסטזיס בתאי שריר: הדמיה של היווצרות צברי חלבונים במהלך ההזדקנות (1.1) ומדידת הפרוטאוקסואליות שאגרגטים אלה גורמים עם הגיל דרך תחילת השיתוק (1.2).
- הדמיה של היווצרות צברי פוליגלוטמין בשריר במהלך הזדקנות
הערה: ההתקדמות תלוית הגיל של צבירת חלבונים בתאי השריר מדומה באמצעות חזרות פוליגלוטמין (polyQ) המאוחות לחלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP). פרוטוקול זה מתאר את השימוש בזן AM140 rmIs132[unc-54p::Q35::YFP], אך ניתן להשתמש גם בזנים אחרים של גרסאות פוליגלוטמין. הטרנסגן polyQ::YFP מבוטא בשריר באמצעות מקדם ספציפי לשריר unc-54. בעלי חיים מסונכרנים unc-54p::p olyQ::YFP המבטאים בעלי חיים מוצגים ביום 1, 2, 3 ו-4 לבגרות. כדי להמחיש אגרגטים unc-54p::p olyQ::YFP, השתמש במיקרוסקופ מורכב המצויד בפלואורסצנטיות או במיקרוסקופ מנתח פלואורסצנטי. AM140 זמין מהמרכז לגנטיקה Caenorhabditis (CGC) בכתובת: https://cgc.umn.edu/strain/AM140
- בימי הדמיה (יום 1, 2, 3 ו-4 לבגרות), בחרו 20 בעלי חיים והרכיבו אותם על מגלשת מיקרוסקופ עם פד אגרוז 3% וטיפה של 5 מיקרוליטר נתרן אזיד 10 מילימטר (מדולל במאגר M9).
- אחרי שכל החיות משותקות על-ידי נתרן אזיד (~ 5 דקות), דמיינו את כל הגוף של החיות באמצעות עדשת הגדלה פי 10 (איור 1A). להדמיה, השתמש במסנן FITC ובאותה חשיפה עבור כל בעל חיים. מחיקת שקופיות לאחר imaging.
הערה: לחלופין, ניתן לכמת מוקדי YFP ישירות על לוחות, אך יש לעכב את התנועה על ידי מריחת זרם של פחמן דו חמצני על הצלחת בזמן הניקוד. שיטה חלופית זו היא המתאימה ביותר בעת סינון מספר רב של תנאים.
- לאחר רכישת תמונות, לספור את מספר מוקדים בשרירי קיר הגוף של החיה כולה. מוקדים הם אותות מנוקדים בהירים יותר שניתן להבדיל בינם לבין האות המסיס העמום יותר ברקע.
- התווה את התקדמות הצטברות מוקדי YFP מימים 1, 2, 3 ו- 4. התווה גרף XY שבו X מייצג ימים של בגרות ו- Y מייצג את מספר המוקדים unc-54p::p olyQ::YFP (איור 1B). מספר המוקדים במצב הניסוי (למשל, הפחתת ויסות גנים או ביטוי יתר) מושווה לחיות ביקורת. בצע ניתוח סטטיסטי בין הקבוצות בכל נקודת זמן שנצפתה עבור כל ניסוי.
- בעת השוואת ספירת מוקדים עבור שני תנאים בלבד, בצע בדיקת t מדגמית בלתי תלויה בכל נקודת זמן.
- בעת השוואת ספירת מוקדים עבור יותר משני תנאים, בצע ניתוח ANOVA חד-כיווני עבור כל נקודת זמן, כולל הנתונים עבור כל התנאים באותה נקודת זמן. אם האומניבוס ANOVA מניב ערך p משמעותי (כלומר, p < 0.005), בצע ניתוח פוסט-הוק עם מבחני t מדגם בלתי תלויים זוגות כדי לקבוע את התנאים הספציפיים שביניהם זוהה הבדל משמעותי במוקדים (למשל, עבור קבוצות A, B ו- C להשוות A & B, A &C ו- B & C).
2. מדידת שיעורי שיתוק בעלי חיים כתחליף לרעילות פוליגלוטמין בתאי שריר
הערה: העלייה תלוית הגיל של צברי polyQ בשריר גורמת לירידה בתפקוד השרירים המניע תנועה. פגם זה בתנועה יכול להיקבע על ידי מדידת הקצב המתקדם של שיתוק בבעלי חיים המבטאים polyQ. עבור בדיקת שיתוק, בעלי חיים מסונכרנים unc-54p::p olyQ::YFP המבטאים בעלי חיים מקבלים ניקוד ביום 3, 5, 7 ו-9 לבגרות. הוסף נקודות זמן נוספות לפי הצורך, כדי להרחיב את טווח הניקוד כך שניתן יהיה להעריך את השפעת ההפרעה הגנטית.
- בימי הניקוד (יום 3, 5, 7 ו-9 לבגרות), התבוננו בלוחות בקוטר 6 ס"מ המכילים 50 בעלי חיים ורשמו את מספר החיות המשותקות. הוציאו בעלי חיים משותקים מהצלחת. אם בעלי חיים זחלו מהצלחת או מתו, יש לצנזר אותם; רשום את האירוע כך שניתן יהיה להסביר אותו בניתוח.
הערה: בעל חיים נחשב משותק כאשר לא נצפתה תנועה לאחר חשיפתו לגירויי מגע קלים או עדינים. פעילות שאיבת הלוע משמשת כדי לקבוע אם בעלי חיים שאינם נעים חיים או מתים.
- בסיום הניסוי, חשב את שיעור השיתוק עבור כל מצב. עשו זאת בכל נקודת זמן על ידי חלוקת החלק של בעלי החיים המשותקים במספר הכולל של בעלי החיים שנצפו באותו מצב. אם אתם מתבוננים במספר לוחות לכל תנאי לכל נקודת זמן (כלומר, משכפלים לוחות), חשבו את היחס בנפרד עבור כל שכפול.
- התווה את התקדמות קצב השיתוק בגרף XY (scatterplot). X מייצג ימים של בגרות, ו-Y מייצג שיעורי שיתוק. שיעור השיתוק של חיות unc-54p::p olyQ::YFP מושווה לחיות ביקורת (איור 1C). לבצע ניתוח סטטיסטי בין הקבוצות; עבור ניסויים מרובים, לטפל בניסויים באופן עצמאי. השתמש ברגרסיה של Cox Proportional-Hazards ובמבחן Wald. רוב כלי ניתוח הנתונים התומכים בניתוח הישרדות תומכים גם במידול קוקס.
- המר את הנתונים: לכל תנאי צריכות להיות שתי עמודות, אחת עבור זמן ואחת עבור "אירוע". בכל נקודת זמן שנצפה, הוסף שורה עם "0" עבור כל חיה משותקת ו- "1" עבור כל חיה מצונזרת. מספר השורות הכולל צריך להיות שווה למספר החיות המתחילות בצלחת עבור מצב זה.
- בצע מידול סיכונים פרופורציונליים של קוקס, ולאחר מכן מבחן Wald, בהתאם להוראות התוכנה הסטטיסטית. מודל חד-משתני יתאים לעיצובי ניסוי טיפוסיים. עבור יותר משני תנאים, אם בדיקה עם כל התנאים הכלולים מצביעה על תוצאה משמעותית (כלומר, p < 0.005), ניתן לבצע בדיקות זוגיות בין תנאים כדי לקבוע את זוגות התנאים המשמעותיים הספציפיים.
הערה: מודל קוקס מסתמך על ההנחה שתנאי הבדיקה מווסתים את ההסתברות לאירוע באופן יחסי לאורך זמן. משמעות הדבר היא, למשל, שמודל קוקס לא יתאים להשוואת מצב שבו רוב בעלי החיים משותקים ביום 1 למצב שבו רוב בעלי החיים משותקים ביום 9. הרחבות של מודל קוקס, וגישות אחרות להשוואת פרופורציות משותקות בכל נקודת זמן, זמינות למקרים שבהם הנחת הסיכונים הפרופורציונליים אינה מחזיקה.
