מאמר שיטה

בדיקת דגירה משותפת של חיידקים: טכניקה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לדמיין תחרות חיידקית תוך ספציפית ברמת התא הבודד

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Smith, S., et al., <a href="https://app.jove.com/v/62851">Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מדגים שיטה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לחקר תחרות חיידקים ברמת התא הבודד. שיטה זו מספקת תובנות לגבי המבנה והתפקוד של קהילות חיידקים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. דגירה של זני חיידקים

  1. בחר שני זנים חיידקיים עבור מבחני תחרות חיידקים חד-תאיים. כאן משתמשים בשני זנים של V. fischeri: זן מטרה (ES11424) וזן מעכב (MJ1125) הידוע כקוטל את זן המטרה באמצעות מערכת הפרשת סוג VI על כרומוזום II (T6SS2)1, שהוא מנגנון הרג תלוי מגע.
  2. התמירו זנים עם פלסמידים יציבים המקודדים גנים לחלבונים פלואורסצנטיים שונים (למשל, GFP או RFP) כדי להבחין חזותית בין סוגי זנים במיקרוסקופ. כאן, הזן המעכב מתויג בפלסמיד מקודד GFP (pVSV102), וזן המטרה מתויג בפלסמיד מקודד dsRed (pVSV208).
  3. התחל עם תרביות אמצע יומן עבור שני הזנים, מדוד ורשום את הצפיפות האופטית ב- 600 ננומטר (OD600) עבור כל הדגימות.
  4. לנרמל כל מדגם ל- OD600 = 1.0, המתאים לכ- 109 CFU/mL עבור V. fischeri, על ידי דילול התרבית עם מדיום LBS.
  5. ערבבו את שני הזנים המתחרים יחד ביחס של 1:1 המבוסס על נפח על ידי הוספת 30 μL מכל זן מנורמל לצינור מסומן של 1.5 מ"ל. מערבולת את תרבית הזן המעורב עבור 1-2 s.
    הערה: במקרים מסוימים, ייתכן שיהיה מתאים לערבב תרבויות משותפות ביחסים שונים. לדוגמה, כאשר זן אחד גדל הרבה יותר מהר מהשני, ייתכן שיהיה צורך להתחיל את הזן הגדל לאט יותר ביתרון מספרי כדי לצפות בתחרות. אופטימיזציה עשויה להידרש גם אם OD600 אינו תואם CFU/mL דומה עבור שני הזנים.
  6. חזור על שלב 1.5 עבור כל שכפול ביולוגי וטיפול. בדוגמה המוצגת כאן, התוצאה תהיה בסך הכל ארבעה צינורות מזן מעורב: שני משכפלים ביולוגיים עם זן מעכב מסוג פרא מעורבב עם זן המטרה ושני שכפולים ביולוגיים עם הזן המוטנטי של מערכת ההפרשה מסוג VI מעורבב עם זן המטרה.
  7. כדי להבטיח שהתאים המתחרים צפופים מספיק להרג תלוי מגע בכרית האגר, רכז כל תרבית מעורבת פי 3 על ידי צנטריפוגה של התרבית המעורבת בצינור צנטריפוגה סטנדרטי של 1.5 מ"ל למשך דקה אחת במהירות של 21,130 x גרם, השלכת הסופרנטנט, והשעיה מחדש של כל גלולה בתווך של 20 μL LBS. חזור על הפעולה עבור כל מדגם.
    הערה: חלק מתאי החיידקים רגישים לנזק על ידי צנטריפוגה ב-RCF גבוה; במקרים כאלה, התרבות המעורבת יכולה להיות צנטריפוגית במשך 3 דקות ב 4600 x גרם. בנוסף, כאשר מכמתים תחרות תלוית מגע, חשוב להבטיח צפיפות תאים מספקת במגלשה כדי לצפות בהרג. במאמר זה, טיפולים "צפופים", שבהם נצפה הריגה, היו בערך 10 תאים / 20 מיקרומטר2.

2. הגדרת שקופיות

  1. בעת שימוש במיקרוסקופ זקוף, הניחו כרית ~ 5 מ"מ2 אגרוז על מגלשת זכוכית סטנדרטית של 1 מ"מ. כתם 2 μL של תרבית מעורבת על כרית האגרוז והניחו כיסוי #1.5 (25 מ"מ2) מעל המקום. ראו איור 1B.
  2. בעת שימוש במיקרוסקופ הפוך, אתר 2 μL של תרבית מעורבת על תחתית הכיסוי #1.5 של צלחת פטרי 35 מ"מ והניחו כרית ~ 5 מ"מ2 אגרוז מעל נקודת המטבע. הניחו כיסוי זכוכית עגול בקוטר 12 מ"מ מעל כרית האגרוז. ראו איור 1C לדוגמה.
  3. חזור על שלבים 2.1 או 2.2, בהתאם להגדרת המיקרוסקופ שבו נעשה שימוש, עבור שלוש התרביות המעורבות הנותרות, והתוצאה תהיה ארבע שקופיות או כלים לצילום.
  4. אפשר לשקופיות לשבת על הספסל במשך כ -5 דקות לפני שתמשיך. זה מאפשר לתאים להתיישב על כרית אגר ולמנוע תנועה במהלך תהליך ההדמיה.

3. מיקרוסקופ פלואורסצנטי

  1. התחל על ידי התמקדות בתאים באמצעות אור לבן (ניגודיות פאזה או DIC) כדי למזער את ההשפעות של הלבנת תמונות. בהתבסס על הגודל הממוצע של תא חיידק יחיד, השתמשו במטרה של שמן פי 60 או פי 100.
  2. התאם את זמן החשיפה ואת הגדרות הרכישה עבור כל ערוץ כך שהתאים יהיו גלויים בערוץ המתאים עם זיהוי רקע מינימלי.
    הערה: ראוי להשתמש בזמני חשיפה שונים לערוצים שונים, אך יש לנצל את אותו זמן חשיפה בכל השכפולים הביולוגיים והטיפולים לערוץ נתון.
  3. לכל דגימה, בחרו לפחות חמישה שדות תצוגה (FOV) וקבלו תמונות בכל ערוץ מתאים בעזרת הגדרות הרכישה (ראו דוגמאות באיור 2). שמור את נקודות XY מכל FOV כך שניתן יהיה לצלם את אותו FOV במהלך נקודת הזמן הסופית. הדמיה של אותו FOV בכל נקודת זמן נחוצה כדי לקבוע את שיעור השטח שנכבש על ידי תאי מטרה או מעכבים במהלך שלבי הניתוח.
    הערה: בדוגמה זו, הפלואורסצנטיות של GFP מזוהה באמצעות מסנן עם אורך גל עירור של 467 - 498 ננומטר ומסנן פליטה של 513 - 556 ננומטר והוא בצבע ירוק כוזב. הפלואורסצנטיות של dsRed מזוהה באמצעות מסנן עם אורך גל עירור של 542 - 582 ננומטר ומסנן פליטה של 603 - 678 ננומטר והוא מגנטה בצבע מזויף.
  4. לאחר שעתיים, חזור על השלב לעיל עבור כל דגימה באמצעות נקודות XY שנשמרו קודם לכן (איור 2).
    הערה: ייתכן שיהיה צורך למטב את העיתוי של התמונות הבאות עבור אורגניזמים בעלי קצב גדילה שונה או מנגנונים תחרותיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1: הכנת כרית אגרוז והגדרת שקופיות למבחני חופפות. (A) התקנה להכנת רפידות אגרוז 2%. חמש שכבות של סרט מעבדה (ירוק) כרוכות סביב פתק כיסוי בשתי נקודות במרחק של כ-20 מ"מ זו מזו. לאחר מכן, חם 2% agarose במי מלח ימיים פוספט חוצץ (צהוב) הוא pipeted בין חתיכות של סרט ומיד מכוסה עם 25מ"מ 2 כיסוי להחליק מותר להתמצק לפחות 1 שעה בטמפרטורת החדר. השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את כרית ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגהפישר05-408-129
10 uL פיפטה ערוץ יחיד
1000 uL פיפטה ערוץ יחיד
20 uL פיפטה ערוץ יחיד
200 uL פיפטה ערוץ יחיד
אגרוזפישרBP165-25אגרוז נמס נמוך
צלחת סלביס 35 מ"מפישרNC0409658#1.5 כיסוי תחתית זכוכית
כלוראמפניקולסיגמאC0378מלאי (20 מ"ג / מ"ל אתנול); ריכוז סופי במדיה (2 מיקרוגרם / מ"ל ליברות)
FIJI ניתוח תמונה sofwareImageJhttps://imagej.net/Fiji/Downloadsתוכנת קוד פתוח
משקפי כיסוי Fisherbrand: עיגוליםפישר12-545-81P#1.5 זכוכית כיסוי; קוטר 12 מ"מ
קנמיצין סולפטפישרBP906-5ציר (100 מ"ג/מ"ל במים, חיטוי מסנן); ריכוז סופי בחומרי הדפסה (1 מיקרוגרם/מ"ל ליברות)
נייר טישו לניקוי עדשותפישרS24530
צלחות פטריפישרFB0875713סטרילי עם מכסה
סכיני גילוחפישרS65921
קוביות חצי מיקרוVWR97000-586
ספקטרופוטומטר
חותם זהב תרמו-מדעי שקופיות מיקרוסקופ רגילפישר12-518-100 ב'
Thermo Scientific Richard-Allan Scientific Cover Glassפישר22-050-235#1.5 כיסוי זכוכית, 25 מ"מ2
שמן טבילה מסוג FפישרNC0297589
מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף או הפוך עם מצלמה ותוכנת הדמיההתמונות במאמר זה נרכשו במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך TI-2 של Nikon המצויד במצלמת ORCA-Fusion Digital CMOS באמצעות תוכנת NIS-Elements.
מערבולת
אמבט מיםמשמש לשמירה על חום האגרוז לפני הפיפטינג
מדיה LBS
1M Tris Buffer (pH ~ 7.5)50 מ"ל מאגר מלאי של 1 מטר (62 מ"ל HCl, 938 מ"ל DI מים, 121 גרם בסיס Trizma)
אגר טכניפישרDF0812-17-915 גרם (הוסף רק לצלחות)
מי DI950 מ"ל
נתרן כלוריפישרS640-320 גרם
טריפטוןפישרBP9726510 גרם
תמצית שמריםפישרBP9727-25 גרם
mPBS (PBS ימי)פוספט חוצץ מלוחים עם מלחים ימיים הוסיף; משמש להכנת כרית אגרוז
10X PBSפישרICN1960454
מלח ים אוקיינוס מיידיאינסטנט אושןSS1-160Pהתאמת הריכוז למליחות מתאימה; 20 PSU בשימוש כאן
יחידות מסנן ואקום סטריליותפישרSCGVU01REמשמש לסינון ועיקור mPBS
משאבת ואקוםמשמש לסינון ועיקור mPBS

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DIC

מאמרים קשורים