בדיקה הומוגנית של קרבה זוהרת מוגברת: בדיקת קרבה מבוססת חרוזים לסינון מולקולות קטנות המעכבות אינטראקציות חלבון-חלבון

תקציר

מקור: Wang, L. et al., מחקרים על אינטראקציות מלווה-מלווה באמצעות בדיקה הומוגנית מבוססת חרוזים. J. Vis. Exp. (2021)

בסרטון זה, אנו מדגימים את המבחן ההומוגני של הקרבה הזוהרת המוגברת – בדיקת קרבה מבוססת חרוזים. הוא משתמש בחרוזי קבלה ותורם בגודל הומוגני, משותקים עם שני חלבונים הנוטים לקיים אינטראקציה כדי לסנן מולקולות קטנות פוטנציאליות המעכבות אינטראקציות חלבון.

פרוטוקול

הערה: סקירה כללית של פרוטוקול זה מוצגת באיור 1.

1. ביטוי וטיהור של GST-FKBP51 ו-GST-FKBP52 (איור 1A)

1. Plasmids
   הערה: השג שיבוטים של cDNA עבור FKBP51 אנושי (מזהה שיבוט: 5723416) ועבור FKBP52 אנושי (מזהה שיבוט: 7474554) מקונסורציום IMAGE.
   1. להגביר את ה- DNA האנושי FKBP51 על ידי PCR עם פריימרים (קדימה; 5'GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3', הפוך; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTCTCTCTCCAC-3') המכיל BamHI ו- XhoI overhangs ולשכפל לווקטור pGEX6-1 באתרי הגבלה BamHI / XhoI.
   2. להגביר את הדנ"א האנושי FKBP52 על ידי PCR עם פריימרים (קדימה; 5'-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3', הפוך; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') המכיל EcoRI ו- XhoI overhangs ולשכפל לווקטור pGEX6-2 באתרי הגבלה EcoRI / XhoI.
      הערה: הגדרת תגובת PCR והתנאים מוצגים בטבלה 1 ובטבלה 2.
   3. אמת את הרצף שהוכנס והפוך את הפלסמידים ל- E. coli הכשיר כימית בהתאם לפרוטוקול הייצור.
2. ביטוי וטיהור חלבונים
   1. הוסיפו 25 גרם של בסיס ציר לוריא (LB) ב-1 ליטר מים מזוקקים כדי ליצור את תמיסת ה-LB. Autoclave אותו ב 121 ° C במשך 15 דקות. לאחר הקירור, מוסיפים אמפיצילין של 50 מק"ג/מ"ל
   .
   2. קח מושבה של חיידקים המבטאים GST-FKBP51 או GST-FKBP52 וערבב עם 500 μL של תמיסת LB בצינור של 1.5 מ"ל. מערבולת.
   3. הוסף את התערובת של "1.2.2" לתוך 1 ליטר של תמיסת LB בבקבוק Erlenmeyer מכוסה ברדיד אלומיניום. לדגור את בקבוק Erlenmeyer בשייקר לילה ב 37 °C (77 °F).
   4. לגרום לביטוי חלבון על ידי הוספת 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) לבקבוק Erlenmeyer ולהמשיך את הדגירה במשך 2 שעות נוספות.
   5. כדי לקבל כדורי תאים, צנטריפוגה ב 5,000 x גרם למשך 15 דקות. להסיר את supernatant.
      הערה: כדורי התא ניתן לאחסן ב -20 ° C.
   6. להשהות מחדש את כדורי התא ב 40 מ"ל של PBS ו sonicate 3 x 20 s על קרח. יש להוסיף 1 mM PMSF, 1 mM EDTA וקוקטייל מעכב פרוטאז (טבליה אחת) כדי למנוע פרוטאוליזה.
   7. צנטריפוגו את המתלה למשך 30 דקות 50,000 x גרם כדי להסיר פסולת תאים ולהחיל את supernatant על 5 מ"ל מלכודת GST-trap.
   8. לאחר שטיפת העמוד עם PBS של 30 מ"ל, יש להבליט את GST-FKBP51 ואת GST-FKBP52 עם 5 מ"ל של 10 מ"ל גלוטתיון ב-PBS.
   9. רכז חלבונים על 15 מ"ל 10.000 MWCO יחידת צנטריפוגה. כדי להסיר גלוטתיון חופשי, יש להעביר תרכיזים דרך עמודת PD-10 המאוזנת ל-PBS של 0.5x ושוב להתרכז בהתקן הצנטריפוגות של המסנן.
   10. אספו שברים המכילים חלבון. אמת את החלבונים ב- SDS-PAGE והתאם את ריכוזי החלבונים ל- 1 מ"ג / מ"ל < / > הערה: תפוקת חלבון אופיינית היא 2-5 מ"ג/ליטר תרבית. ניתן לאחסן את החלבון בטמפרטורה של -20°C.

2. צימוד של פפטיד Hsp90 C-terminal לחרוזי הקבלה (איור 1B)

1. הכנת פפטיד Hsp90
   1. סנתז עשרה פפטידי חומצות אמינו NH 2-EDASRMEEVD-COOH המתאים לחומצות אמינו 714-724 של איזופורם בטא Hsp90 אנושי (מזהה UniProt: P08238) על ידי שירות סינתזת פפטידים.
   2. יש לדלל את הפפטיד Hsp90 ב-PBS לריכוז של 1 מ"ג/מ"ל.
2. הכנת חרוזי קבלה
   1. לדלל את חרוזי הקבלה הלא מצומדים ב- PBS לריכוז של 1 מ"ג / מ"ל ולהעביר לצינור של 1.5 מ"ל.
   2. בצע את השטיפה באמצעות צנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 15 דקות. בזהירות להסיר את supernatant.
3. צימוד
   1. הגדר את היחס בין חרוזים לפפטיד כ- 10:1. בצינור 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ג של גלולת חרוז מקבל (מוכן כמתואר לעיל), להוסיף 1 מ"ל של PBS (pH 7.4), 0.1 מ"ג של פפטיד מדולל, 1.25 μL של Tween-20, 10 μL של תמיסה 400 mM של cyanoborohydride נתרן (NaBH₃CN) במים.
      זהירות: NaBH₃CN הוא רעיל; השתמשו במכסה אדים וכפפות. פתרון NaBH₃CN צריך להיות מוכן טרי.
   2. יש לדגור במשך 24 שעות ב-37°C עם תסיסה מקצה לקצה (10-20 סל"ד) על שייקר סיבובי.
4. מרווה תגובה ושטיפת חרוזים
   1. הוסף 20 μL של 1 M Tris-HCl (pH 8.0) פתרון לתגובה לחסום אתרים לא מגיבים. לדגור במשך 1 שעה ב 37 ° C.
   2. צנטריפוגה ב-16,000 x גרם (או מהירות מרבית) למשך 15 דקות ב-4°C. הסר את הסופרנאטנט והשהה מחדש את גלולת החרוז ב-1 מ"ל של תמיסת Tris-HCl (100 mM, pH 8.0).
   3. חזרו על שלב הכביסה שלוש פעמים.
   4. לאחר הצנטריפוגה האחרונה, השהה מחדש את החרוזים ב 1 מ"ג / מ"ל במאגר אחסון (1 מ"ל של 0.5 × PBS עם 0.01% נתרן אזיד כחומר משמר). אחסן את תמיסת חרוזי המקבל המצומד בטמפרטורה של 4°C אור מוגן.
      זהירות: נתרן אזיד הוא רעיל; השתמשו במכסה אדים וכפפות.

3. הבדיקה בוחנת את האינטראקציה בין GST-FKBP51 או GST-FKBP52 ופפטיד Hsp90 C-terminal, ועיכוב עם תרכובות מסה מולקולרית קטנות (איור 1C)

1. חלבונים עם תיוג GST המקיימים אינטראקציה עם חרוזים של תורם גלוטתיון
   1. הגדר את התגובות בצלחות 384 בארות.
   2. הכינו את התמיסה המכילה 10 מיקרוגרם/מ"ל של חרוזי תורם גלוטתיון ב-0.5x PBS, pH 7.4.
      הערה: לאחר אחסון ממושך, החרוזים מתיישבים ויש צורך לערבל אותם.
   3. הוסף GST-FKBP51 או GST-FKBP52 לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל.
   4. יש לדגור בחושך ב-25°C למשך 10 דקות
      הערה: בשלב זה, חלבונים המסומנים ב-GST יקיימו אינטראקציה עם גלוטתיון המחובר לחרוזים. עבור כל באר, 22.5 μL של תערובת זו ישמש. ריכוז השותפים המחייבים חייב להיקבע אמפירית. טיטרט GST-FKBP51 ו- GST-FKBP52 ובחר את הריכוז שנותן את האות הטוב ביותר.
2. תוספת מורכבת
   1. בצע דילולים סדרתיים של תרכובות בדיקה ב- DMSO.
      הערה: הריכוזים המשמשים הם בדרך כלל 10, 30, 100, 300, 1,000 ו -3,000 מיקרומטר.
   2. הוסף 0.25 μL של DMSO (בקרה שלילית) או פפטיד Hsp90 C-terminal (בקרה חיובית, 30 μM) או תרכובות ב- DMSO לפינה של כל באר של הצלחת. השתמש triplicates עבור כל ריכוז מורכב.
   3. הוסף 22.5 μL של תמיסה המכילה חרוזים מתורם גלוטתיון עם חלבונים מסומנים GST לכל באר.
   4. נערו את הצלחת בעדינות עם היד אך ביסודיות. יש לדגור בחושך ב-25°C למשך 15 דקות
      הערה: במהלך תקופה זו, תרכובות יקיימו אינטראקציה עם תחום TPR באתר הקישור הפפטידי Hsp90 C-terminal.
3. תוספת חרוזי קבלה
   1. לדלל את חרוזי הקבלה עם פפטיד Hsp90 C-terminal מחובר ל 100 מיקרוגרם / מ"ל ב 0.5x PBS.
   2. מוסיפים 2.25 μL של חרוזי קבלה מדוללים לכל באר.
   3. מערבבים בעדינות אך ביסודיות. יש לדגור בחושך ב-25°C למשך 15 דקות
      הערה: בשלב זה, חרוזי תורם ומקבל מובאים לקרבה על ידי אינטראקציות חלבון-פפטידים. הנפח הסופי של תערובת התגובה הוא 25 μL. לכן, הריכוזים הסופיים של תרכובות נעים בין 0.1 ל 30 מיקרומטר.
4. קריאת צלחת
   הערה: קרא את הצלחת באמצעות קורא לוחות שהוגדר במצב הרלוונטי.
   1. הפעל את המכשיר ופתח את התוכנה
   2. בחר את הפרוטוקול הרלוונטי.
   3. לחצו על 'ערוך מפת לוחות' ובחרו את הבאר המשמשת בלוח למדידה.
   4. לחץ על הבא כדי להמשיך והפעל את הפרוטוקול שנבחר.
   5. לאחר המדידה, לחצו על 'הצג תוצאות' כדי להציג תוצאות.
   6. יצא את הנתונים.

טבלה 1: תגובת PCR מוגדרת להגברה של DNA אנושי FKBP51 ו-FKBP52.

רכיב תגובה	נפח (μL)
מאגר PCR (5 x תרכיז)	4
פריימר קדימה	1
פריימר הפוך	1
פלסמיד	0.5
תערובת dNTP (10 mM כל אחד)	0.5
פוסיון DNA פולימראז	0.5
מים (דרגת DNA)	12.5
סך	20

טבלה 2: תנאי תרמוציילר להגברת DNA FKBP51 ו-FKBP52 אנושית.

במה	טמפרטורה (°C)	זמן	מחזורים
דנטורציה ראשונית	94	3 דקות	1
דנטורציה	94	30 שניות	35
חישול	56	30 שניות
סיומת	72	1 דקות
הארכה סופית	72	5 דקות	1
הערה: טמפרטורת המכסה היא 105 °C.

תוצאות

איור 1: סכמטיות של פרוטוקול זה. (A) ביטוי וטיהור של GST-FKBP51 ו-GST-FKBP52. (B) צימוד של פפטיד Hsp90 C-terminal לחרוזים המקבלים. (C) הבדיקה הבודקת את האינטראקציה בין GST-FKBP51 או GST-FKBP52 ופפטיד Hsp90 C-terminal. עיכוב עם תרכובות מסה מולקולרית קטנות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחות 384 בארות	פרקין אלמר	6008350	נפח Assay 25 מ"ל
יחידת צנטריפוגה Amicon 10.000 MWCO	מיליפור	UFC901008	חלבון מרוכז
אמפיצילין	סיגמא	A0166	אנטיביוטיקה
שייקר חיידקים Unimax 1010	היידולף		חיידקים בתרבית
שיבוטים cDNA עבור FKBP51 אנושי	מקור: BioScience	מזהה שיבוט: 5723416	וקטור pCMV-SPORT6
שיבוטים cDNA עבור FKBP52 אנושי	מקור: BioScience	מזהה שיבוט: 7474554	וקטור pCMV-SPORT6
E. coli בעל יכולת כימית	Invitrogen	C602003	כוכב BL21 ירייה אחת (DE3)
DMSO	סופלקו	1.02952.1000	תרכובות מדוללות
DPBS	גיבקו	14190-144	הכנת פתרון
EDTA	קלביוכם	344504	מניעת פרוטאוליזה במהלך סוניקציה
גלוטתיון	סיגמא	G-4251	Elute חלבונים עם תיוג GST
חרוזים מתורם גלוטתיון	פרקין אלמר	6765300	חרוז תורם
עמודת השמנת GST	Cytiva (GE Healthcare)	17528201	טיהור חלבונים המתויגים ב-GST
איזופרופיל-β-D-תיוגלאקטוזיד	תרמו פישר סיינטיפיק	₪199	השראת ביטוי חלבונים
LB מרק (מילר)	סיגמא	L3522	מדיום גידול מיקרוביאלי
מכשיר PCR	ביו-ראד	S1000 Thermal Cycler	הגברה/PCR
עמודת PD-10	Cytiva (GE Healthcare)	17085101	החלפת פתרונות
וקטור pGEX-6P-1	Cytiva (GE Healthcare)	28954648	פלסמיד
וקטור pGEX-6P-2	Cytiva (GE Healthcare)	28954650	פלסמיד
קורא צלחות	פרקין אלמר	EnSpire 2300 קורא תוויות מרובות	קריאת לוח אלפא
תוכנת קורא צלחות	פרקין אלמר	מנהל EnSpire	תוכנת קורא צלחות
פרוטוקול תוכנה לקורא צלחות	פרקין אלמר	אלפא 384-באר נפח נמוך	השתמש בפרוטוקול זה כדי לקרוא צלחת
PMSF	סיגמא	P7626	מניעת פרוטאוליזה במהלך סוניקציה
קוקטייל מעכב פרוטאז	סיגמא	S8830	מניעת פרוטאוליזה במהלך סוניקציה
נתרן אזיד	סיגמא	S2002	כחומר משמר
נתרן ציאנובורוהידריד (NaBH3CN)	סיגמא	156159	הפעלת מטריצה לצימוד
עשרה פפטידי חומצות אמינו NH2-EDASRMEEVD-COOH המתאים לחומצות אמינו 714-724 של איזופורם בטא Hsp90 אנושי	פפטיד 2.0 inc		לסנתז פפטיד Hsp90 C-terminal
מסובב מבחנה	לבינקו		התסיסה מקצה לקצה
Tris-HCl	סיגמא	10708976001	חסום אתרים לא מגיבים של חרוזי קבלה
טווין-20	סיגמא	עמ' 1379	מניעת צבירת חרוזים
אולטרה צנטריפוגה Avanti J-20 XP	בקמן קולטר		צנטריפוגה לקבלת כדורי תאי חיידקים
משבש תאים קולי	מיקרוסון		סוניזציה של תאים כדי לשחרר חלבון
חרוזי קבלה לא מצומדים	פרקין אלמר	6762003	חרוזי קבלה
מודול XCell SureLock Mini-Cell ו-XCell II Blot	Invitrogen	EI0002	דף SDS