בדיקת פלאק וירוס: טכניקה למדידת וירוס הרפס סימפלקס זיהומי באמצעות כימות של רבדים שנוצרו בשכבה אחת של תאים נגועים בנגיף

תקציר

מקור: Sadowski, L. A. et al. Plaquing of Herpes Simplex Viruses. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מתאר את בדיקת רובד הנגיף של נגיף הרפס סימפלקס מדבק או HSV. החלקיקים הנגיפיים המדוללים מחוסנים לשכבה החד-שכבתית של תאי אפיתל. עם הדגירה, הנגיף יוצר פלאקים ונספר חזותית כדי לקבוע את titer הנגיף זיהומיות.

פרוטוקול

1. זריעה של תאי Vero

1. יום לפני תחילת בדיקת הפלאק, טריפסינזה תאי ורו והשהתה אותם מחדש במדיום נשרים מעובדים רגילים של דולבקו (DMEM) והשלימו בהתאם למתודולוגיית תרבית התאים הסטנדרטית. להשעות מחדש את התאים טריפסיניים ב 10 מ"ל של DMEM לכל בקבוק T-75 של תאי Vero מפגש (~ 10⁷ תאים).
   הערה: DMEM משמש לבדיקות פלאק במקום אלפא-MEM מכיוון שהוא מאט מעט את קצב צמיחת התאים ומעדיף תוצאות טובות יותר של בדיקת פלאק.
2. ספור את התאים לפי השיטה המועדפת עליך (למשל, המוציטומטר סטנדרטי עם אי הכללת Trypan Blue).
3. זרע את התאים ב 4 x 10⁶ תאים / צלחת; עבור HSV-2, להשתמש 6-באר צלחות עם 2.5 מ"ל של DMEM (עם תוספים) לכל באר; ועבור HSV-1, להשתמש 12-באר צלחות עם 1.25 מ"ל של DMEM (עם תוספים) לכל באר.
   הערה: מספר התאים צריך להיות קבוע ללא קשר ללוח שבו נעשה שימוש, אם כי גודל הבארות משנה לגבי דיוק בבדיקת הפלאק. חיוני לקבל תאים מפוזרים באופן שווה, אשר ניתן להשיג בצורה היעילה ביותר על ידי הזזת הצלחת קדימה ואחורה, לא בצורה מעגלית.
4. לאפשר לתאים לגדול בן לילה ב 37 ° C / 5% CO₂ באינקובטור לח.
   הערה: הלחות נשמרת עם מחבת מים מזוקקים המכילה קוטל אלג'ים בתחתית האינקובטור.

2. דילול דגימה

1. השלם את דילול הדגימה ואת הוספת הנגיף לתאים במפגש מעבדה אחד.
   זהירות: HSV-1 ו-2- מדבקים בבני אדם ויש לטפל בהם תחת הכלה נאותה של בטיחות ביולוגית (BSL-2). יש להפריד בין כל החומרים הבאים במגע עם הנגיף ולחטא באמצעות חומר רבעוני בדילול 1/256 (ראה טבלת חומרים), יודופור, אקונומיקה או חומר ניקוי יוני חזק (לדוגמה, SDS) לפני הסרתם מארון הבטיחות הביולוגית.
2. יום לאחר הזריעה של תאי ורו, לדלל באופן סדרתי כל דגימת וירוס כדי להיות plaqued ב 1x PBS; בדרך כלל להשתמש דילול פי 10 עבור מעקב מדויק ביותר.
3. בצע דילולים אלה דרך ^10-4 (עבור ריכוזים נמוכים של וירוסים) או דרך ^10-9 (עבור ציפיות לדגימות טיטר גבוהות יותר) עם לפחות 1 מ"ל מכל דגימה שנותרה לבדיקת הפלאק עצמה.
4. שמור את כל הדילולים הנגיפיים על קרח (לא יותר מ 1 שעה) עד מוכן להוסיף דגימות וירוס מדולל אלה לתאים.

3. הוספת וירוס לתאים

1. הסר את מדיום תרבית התא מבאר אחת או שתיים על ידי פיפטה.
   הערה: אין להשתמש בשואב מכיוון שהוא מסיר יותר מדי נוזלים מהחד-שכבה של התא ומייבש את התאים החוצה. שיקול מכריע אחד הוא להבטיח כי monolayer התא נשאר hydrated לאורך כל הניסוי. אם התאים מתייבשים, הם ישטפו את הצלחת בשלב הסופי וייצרו נתונים בלתי שמישים. לכן, לעבד רק באר אחת או שתיים בכל פעם כדי לצמצם אפשרות זו.
2. בזהירות להוסיף את דגימת וירוס מדולל (100-400 μL ו 50-200 μL של דגימת וירוס משמשים 6-well ו 12-well צלחות, בהתאמה) dropwise לכל monolayer, הוספת טיפות בצד של כל באר. חזור על התהליך עבור כל באר אחת או שתיים עד שכל הצלחת מתמלאת בדגימות הנגיף המונחות plaqued.
   הערה: הוספת הטיפות למרכז הבאר עלולה להחליק תאים מהמצע בשוגג.
3. נענעו בעדינות את כל הצלחת ביד כדי להבטיח שה-PBS המכיל את הנגיף מכסה את כל שכבת התאים בכל באר, ואז הניחו את הצלחת באינקובטור CO₂ בטמפרטורה של 37°C כדי לאפשר לווירוס לספוח.
4. כל 10 דקות בתוך שעה אחת, הסר את הצלחת מהאינקובטור, נדנד אותה שוב בעדינות כדי להפיץ את הנגיף באופן שווה יותר על פני כל באר, ולאחר מכן החזיר אותה לאינקובטור.
   הערה: כל ניסוי יכתיב את מספר העותקים המשוכפלים ואילו דילולים ישמשו; העדפתו של הקורא מכתיבה החלטה זו.
5. כדי לצמצם את האפשרות לספור בשוגג חיסונים שלא נספגו, הסר את דגימת הנגיף מהבארות עם קצות פיפטה של 1000 μL והנח אותה במיכל פסולת.
   הערה: שוב, הליך זה מתבצע רק עם באר אחת או שתיים בכל פעם כדי לשמור על הידרציה של monolayer התא.
6. מניחים 2.5 מ"ל של שכבת על של מתילצלולוז (ממיסים 5% מתילצלולוז עם W ב-100 מ"ל PBS, אוטוקלאבים למשך 15 דקות ב-121°C ו-15 psi במחזור נוזלי, ואז מוסיפים 375 מ"ל DMEM ועוד 25 מ"ל FBS).
7. ברגע שצלחת שלמה מכילה שכבת-על, מחזירים את הצלחת לאינקובטור כדי לאפשר צמיחה במשך יומיים.
   הערה: אם מאפשרים לנגיף ולתאים לגדול במשך שלושה ימים, אפילו ב- DMEM בתוספת תוספים, עלול להיגרם אובדן משמעותי של תאים בשכבה החד-שכבתית, ובכך לסכן את הנתונים הסופיים.
8. יש לחטא את כד הפסולת, בדרך כלל בתוספת אקונומיקה, יודופור או וירוציד דומה, לפני הוצאתו מארון הבטיחות הביולוגית.

4. צביעה לפלאקים

1. לאחר הדגירה בת היומיים, הסירו את שכבת המתילצלולוז על ידי פיפטה, שוב באר אחת או שתיים בכל פעם, והניחו אותה במיכל פסולת.
2. הוסף ~ 2 מ"ל של 1% סגול קריסטל (ראה טבלה של חומרים) ב 50% אתנול לכל באר כדי להכתים את הלוחות.
   הערה: אין זה הכרחי להסיר כל טיפה אחרונה של שכבת העל.
3. לדגור על הצלחת עם כל הבארות מלאות הכתם במשך 30 דקות ב 37 ° C. בשלב זה, יש לחטא את הפסולת כנ"ל בשלב 3.8.
4. שטפו את הצלחות במרץ במי ברז עד שהנגר העילי נקי.
   הערה: זרם עדין של מים אינו נמרץ מספיק; נדרש לחץ מלא ממתקן כיור מעבדה.
5. בשלב זה, ודא שיש הבדלים של בערך פי 10 במספר הפלאק בכל סדרת דילול.
6. הניחו לצלחות להתייבש למשך הלילה הפוך, ולאחר מכן ניתן לספור את הפלאק הבודד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחות 12 בארות	קורנינג	3512
צלחות 6 בארות	קורנינג	3516
אלפא-מם	לונזה	12169F
אנטיביוטיקה/אנטי-מיקוטית	גיבקו	15240096
סגול קריסטל	אלפא עזר	B2193214
DMEM	גיבקו	11965092
PBS של Dulbecco (ללא Mg++ או Ca++)	גיבקו	14190144
נסיוב עגל עוברי	מיליפור-סיגמא	TMS-013-B
ל-אלניל-ל-גלוטמין (גלוטמקס)	גיבקו	GS07F161BA
המציטומטר	תרמו פישר	02-671-54
מתילצלולוז	מיליפור-סיגמא	27-441-0
סוכן רבעוני (Lysol I.C.)	תרמו פישר	NC9645698
כחול טריפאן	קורנינג	25900CI
טריפסין	ציטיבה	SH30042.01
תאי Vero	ATCC	CCL-81