dUTP Nick End-Labeling בתיווך Terminal Transferase – בדיקת TUNEL: שיטה באתרה לזיהוי פיצול DNA בתאים אפופטוטיים

תקציר

מקור: Brannelly, L. A., et al. Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) ו- Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis. J. Vis. Exp. (2018).

בסרטון זה, בדיקת TUNEL מבוצעת כדי לזהות נוכחות של תאים אפופטוטיים בדגימה. המחקר כולל שימוש ב- DNA פולימראז מיוחד - terminal deoxynucleotidyl transferase - המזרז את ההוספה של dUTPs מסומנים למסוף 3' של DNA מקוטע, שניתן לצפות בו ולזהות אותו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. בדיקת TUNEL

1. המתת חסד של בעלי חיים המראים סימנים קליניים של כיטרידיומיקוזיס ומספר שווה של חיות בקרה שליליות Bd.
2. יש לנתח דגימות עור (גבי, גחון וירך) מכל חיה. תקן את דגימות העור למשך שעתיים בפורמלדהיד חוצץ v/v פוספט 4%. זמן התיקון הקצר והעקבי מאפשר קיבוע מלא של הרקמות, אך גם מאפשר צביעה אימונוהיסטוכימית יעילה ומדויקת. לאחר מכן להעביר ל 80% אתנול עד הטבעה עבור חתך.
3. יש להטמיע את העור בשעוות פרפין להכנה היסטולוגית בשיטות סטנדרטיות. בקצרה, הפרוטוקול הוא כדלקמן:
   1. לייבש רקמות בסדרה מדורגת של אתנול ולנקות את האתנול עם xylene. הטמיעו את הרקמה בשעוות פרפין והניחו את כל שלוש דגימות העור של כל אדם בבלוק פרפין אחד.
4. חתך את העור באמצעות מיקרוטום בהתאם לתכשיר היסטולוגי סטנדרטי. חתכו את הרקמה באופן סדרתי ב-5 מיקרומטר ולאחר מכן הדביקו אותה לשקופיות זכוכית הידרופיליות. מקם ארבעה היסטוקט טורי לכל סוג עור בכל שקופית. צור שלוש שקופיות לכל אדם עם קטעי עור טוריים, זכור שבכל שקופית מוצמדים ארבעה מקטעים מכל רקמה.
5. הכתימו את השקופיות בסדר הבא:
   1. הכתימו את השקופית הראשונה עם hematoxylin ואחריו eosin counterstaining (H&E). שקופית זו נועדה לדמיין את המיקום של ספורנגיה Bd בתוך העור.
   2. הכתימו את השקופית השנייה לאחר בדיקת TUNEL הזמינה מסחרית להכנה היסטולוגית ועקבו אחר הוראות היצרן, המתוארות להלן.
      1. ראשית, פרפין את חלקי הרקמה בצנצנת קופלין על ידי שטיפת המגלשות עם שלושה שינויים של קסילן במשך 5 דקות לכל כביסה ולאחר מכן עם שני שינויים של 100% אתנול במשך 5 דקות כל כביסה. לאחר מכן יש לבצע שטיפה אחת של 95% אתנול למשך 3 דקות ולאחר מכן 70% אתנול למשך 3 דקות. סיימו עם שטיפה אחת של PBS למשך 5 דקות.
      2. יש לטפל ברקמה עם אנזים מעכל חלבון מדולל טרי (פרוטאינאז K בריכוז של 20 מק"ג/מ"ל מדולל ב-PBS), ולהוסיף ישירות לשקופית. מניחים לדגור במשך 15 דקות. לשטוף עם שני שינויים של PBS בצנצנת coplin במשך 2 דקות כל אחד.
      3. יש לסלק את עודפי הנוזל ולהרוות 3.0% מי חמצן ב-PBS בצנצנת קופלין למשך 2 דקות בטמפ' החדר. יש לשטוף פעמיים עם PBS, במשך חמש דקות כל כביסה.
      4. יש לנתק את עודפי הנוזל ולאחר מכן למרוח 75 μL/5 ס"מ² של חיץ שיווי המשקל ישירות על הרקמה בשקופית. דגירה במשך 10 שניות. יש לטפוח את עודפי הנוזל סביב המקטע ולמרוח 55 μL/5 ס"מ² של אנזים deoxynucleotidyl transferase (TdT) מסוף עבודה. לדגור בתא לח במשך 1 שעה ב 37 ° C.
      5. לאחר הדגירה של TdT, הניחו את המגלשה בצנצנת קופלין של חיץ עצירה/שטיפה של כוח עבודה, התסיסו במשך 15 שניות ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את המגלשה עם שלושה החלפות של PBS למשך דקה אחת לכל כביסה. יש להסיר את עודפי הנוזלים.
      6. יש למרוח אנטי-דיגוקסיגנין מצומד (רודמין) שחומם לטמפרטורת החדר על הרקמה, 65 μL/5 ס"מ². יש לדגור בתא לח למשך 30 דקות בטמפ' החדר ולהימנע מחשיפה לאור. יש לכבס עם 4 החלפות של PBS למשך 2 דקות לכל כביסה. יש להסיר את עודפי הנוזלים.
      7. סיים על ידי הוספת 15 μL של 0.5 - 1 מיקרוגרם / מ"ל DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) בתווך הרכבה שקופיות לשקופית, המשמש ככתם נגדי. לאחר מכן מכסים בכיסוי ואוטמים בלק ציפורניים או מלט גומי. אפשר לשקופיות להתייבש בחושך מכיוון שהבדיקה רגישה לאור.
   3. צבעו את השקופית השלישית באמצעות בדיקת TUNEL וכתם נגדי DAPI, אך השתמשו בה כבקרה חיובית ושלילית עבור כל דגימה.
      הערה: מתוך 4 ההיסטוקטורים בשקופיות הבקרה, 2 הראשונים הם משוכפלים של בקרה חיובית ו-2 האחרונים הם משכפלים של בקרה שלילית.
      1. עבור הבקרות החיוביות, במקום שלב 1.5.2.2, טפלו מראש ברקמה עם מאגר DN (בסיס טריזמה 30mM, pH 7.2, 4mM MgCl₂, 0.1mM DDT) ותנו לדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. לאחר מכן ממיסים את Dnase I במאגר DN לקבלת ריכוז סופי של 0.1ug/mL, ומיישמים אותו ישירות על השקופית. יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את המגלשה עם 5 שטיפות של dH₂O במשך 3 דקות כל כביסה. כתם את עודפי הנוזלים. לאחר מכן חדש את בדיקת TUNEL בהתאם להוראות בסעיף 1.5.2.3.
      2. עבור הבקרות השליליות, אין להוסיף את האנזים הטרמינלי deoxynucleotidyl transferase (TdT) לדגימות אלה (כמתואר בסעיף 1.5.2.4).

2. צפה בשקופיות TUNEL מיד עם השלמת הבדיקה.

1. צלמו תמונות במרווחי זמן אקראיים לאורך כל חלק עור במהירות של 200X באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, באמצעות פילטרים הן לכתם הרודמין, החושף את התאים האפופטוטיים ונראה אדום, והן ל-DAPI החושף את כל הגרעינים ונראה כחול, כך שניתן ליצור שכבת על של תאים. ודא שלפחות 100 תאים מצולמים בכל קטע עור בכל דגימה. אחסן את השקופיות בקופסת מיקרוסקופ כהה בטמפרטורה של -20°C.
2. ספירת תאים (DAPI כחול מוכתם) לכל תמונה. ודא שלפחות 100 תאים נספרים בכל חתך עור. כדי להגיע ל- 100 תאים, ספרו את כל התאים בתמונה. אם יש פחות מ-100 תאים בתמונה אחת, ספרו תמונה אחרת עד שיגיעו לפחות 100 תאים לכל מקטע עור לכל חיה.
3. לאחר מכן, ספור את מספר התאים החיוביים TUNEL באותן תמונות (רודאמין אדום מוכתם). תאים חיוביים לטונל, המעידים על אפופטוזיס ולא על נמק או רקע, הם תאים בודדים עם קצוות תאים ברורים (הממברנות שלמות ללא ליזה). לפעמים התאים מתכווצים ויוצרים גופים אפופטוטיים.
4. אתר את האזורים שנספרו בבדיקת TUNEL ונתח את האזורים המתאימים בהיסטוסקציות המוכתמות של H&E. ודא כי החלקים המוכתמים ב- H&E מתאימים לאתרים של זיהום Bd, מה שמבטיח שימוש באתרים נגועים ב- Bd בעת ספירת תאים אפופטוטיים בבדיקת TUNEL.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
POLARstar אומגה	BMG Labtech		קורא לוחות זוהר
384 צלחת תחתונה שטוחה ושקופה היטב	קורנינג	3707
384 צלחת תחתונה שטוחה לבנה אוגן נמוכה היטב	קורנינג	3570
פורמלי-Fixx 10% פורמלין חוצץ נייטרלי	פישר	6764254
ערכת זיהוי אפופטוזיס ApopTag אדום באתרו	מרק מיליפור	S7165
PBS (מלח חוצץ פוספט), pH 7.2 (1X)	תרמו/חיים	20-012-043
פארפילם	במיס	PM996
אתנול, 200 הוכחה, כיתה מולקולרית	פישר	BP2818500
ZEISS Axio Scan miscroscope florescent	קרל זיס		מיקרוסקופ פלורסנט
צלחות פטרי תרבית תאים	אנונימי	263991