כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הביקורת הווטרינרית JoVE.
1. גידול בעלי חיים ופיקוח
עליהם
- בית בעלי החיים בנפרד, בסביבה המתאימה למין, עם לוח זמנים מתאים למים, האכלה וניקיון. בדוק בעלי חיים מדי יום.
- השתמש בפרטים בוגרים של Litoria verreauxii alpina (עבור מבחן Caspase 3/7, סעיף 4), שנתרמו ממתקני רבייה בשבי. שמור על בעלי החיים ב 15 - 18 מעלות צלזיוס, על מצע טחב וחצץ, ערפל אותם מדי יום עם מי אוסמוזה הפוכה, והאכיל אותם 3 פעמים בשבוע עם צרצרים עמוסי מעיים.
- אסוף נתונים על כל אדם פעם בשבוע. ספוג את האנשים עבור Bd כמתואר בשלב 2.1. שקלו כל בעל חיים עד למשקל הקרוב ל-0.1 גרם באמצעות מאזניים, ומדדו את אורך החוטם לאוורור (SVL) עד ל-0.01 מ"מ הקרוב ביותר באמצעות קליפרים של חוגה.
- לאחר החיסון (כמתואר בסעיף 3), יש לבדוק את בעלי החיים מדי יום לאיתור סימנים קליניים של זיהום (רפיון עור לא סדיר, חוסר יכולת, אדמומיות ברגליים, עייפות או רפלקס תיקון מאוחר) בהתאם להנחיות האתיקה של בעלי החיים. יש להרדים בעלי חיים אם קיימים סימנים קליניים ותחלואה.
- המתת חסד עם מנת יתר של טריקאין מתאן-סולפונט (MS222) (0.1% עם MS222 עד pH 6-7 עם סודיום ביקרבונט במי ברז מיושנים). שמור בעלי חיים ב- MS222 למשך 10 דקות לאחר שכל התנועה נפסקת והם אינם מפגינים תגובה לגירויים.
2. בדיקת זיהום Bd
- Swabbing עבור Bd
- מקלון כל חיה עם מקלון קרניים סטרילי חדש (מטוש אחד לכל חיה). השתמש בשיטת המטוש הבאה: חמש פעמים על פתח האוורור וחמש פעמים על כל ירך, צד וגפה. זה בסך הכל 45 פעימות.
- סובב בעדינות את המקלון במהלך ובין משיכות כדי להבטיח לכידה יעילה של DNA. יש לשבור את קצה המקלון לצינורות מיקרוצנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל ולאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לשאיבה.
- מיצוי DNA ובדיקת qPCR
- לחלץ DNA גנומי מן המקלונים על ידי הוספת 50 μL של מגיב מיצוי DNA זמין מסחרית עם 30 - 40 מ"ג של 0.5 מ"מ חרוזי סיליקה. חרוז הכה את הדגימות במשבש תא מקציף חרוזים במהירות מקסימלית במשך 2 דקות. לאחר שלב מקציף החרוזים, צנטריפוגו את הדגימות במהירות של 2,000 x גרם למשך דקה אחת.
- לדגור את הדגימות ב 100 ° C במשך 10 דקות, ולאפשר להם להתקרר. צנטריפוגה את הדגימות ב 5,000 x גרם במשך 3 דקות, ולאחר מכן להעביר את supernatant לצינורות מיקרוצנטריפוגות בודדים 1.5 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C עד qPCR.
- השתמש PCR כמותי (qPCR) בעקבות Boyle et al. 2004 כדי לנתח את עומס הזיהום. השתמש בשינויים הבאים:
- יש לדלל דגימות מיצוי DNA ביחס של 6:100 עם מים שעברו דה-יוניזציה כפולה. הוסף 0.7 μL של אלבומין בסרום בקר (BSA) לכל באר כדי לסייע במניעת עיכוב PCR. הפעל כל דגימה בסינגליקט. בכל צלחת השתמשו בבקרה שלילית (ללא תבנית) ובבקרה חיובית עם סדרה של תקני דילול כדי להעריך עומס זואוספור (זיהום).
3. חיסון
- תרבות Bd
- הכינו ציר תרבית על ידי הוספת 16 גרם טריפטון, 2 גרם הידרוליזה ג'לטין, ו 4 גרם לקטוז (TGHL) ל 1 ליטר של מים deionized. Autoclave (121 ° C במשך 40 דקות) ולאפשר את המרק להתקרר.
- לחסן Bd לבודד (במקרה זה, מבודד מניו סאות 'ויילס לבודד, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, מעבר מספר 11) במרק TGHL ולגדול עבור 7 d ב 23 ° C, ולאחר מכן להעביר את תרבית מרק צלחות אגר TGHL.
- כדי להפוך צלחות, להוסיף 16 גרם של טריפטון, 2 גרם של הידרוליזט ג'לטין, 4 גרם של לקטוז (TGHL), ו 10 גרם של אגר בקטריולוגי 1 L של מים deionized autoclave (121 ° C במשך 40 דקות). ברגע שהתערובת קרירה מספיק למגע, אך לפני שהיא מתמצקת, יוצקים את אגר TGHL ללוחות תרבית בקוטר 92 מ"מ כך שיהיו 1/4 עד 1/3 מלאים, בארון בטיחות ביולוגי Class II.
- כאשר האגר התמצק והתקרר לחלוטין, לחסן כל צלחת עם 0.5 מ"ל של Bd מן המרק הנוזלי, ולהפיץ באופן שווה. הניחו לתערובת ציר Bd להתייבש על צלחת למשך כשעה ולאחר מכן אטמו את הצלחות בסרט פרפין מפלסטיק. לדגור צלחות אגר בצד למטה ב 23 ° C עבור 5 - 7 d.
- צלחות הצפה לתמיסת חיסון זואוספורים
- בדוק את תנועתיות הנבגים תחת מיקרוסקופ אור הפוך כדי להבטיח קיום מדי יום לפני החיסון. כאשר שחרור הזואוספורים גבוה, כאשר זואוספורים רבים שוחים מחוץ לספורנגיה, התרבות מוכנה לחיסון.
- הציפו כל צלחת ב-3 מ"ל מי ברז מיושנים או מי בריכה מלאכותיים, על ידי שפיכת המים לצלחת ודגירתם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי לאפשר לזואוספורים להשתחרר למים. לאחר תקופת הדגירה, דקנו את תרחיף הזואוספור למיכל סטרילי חדש.
- הערכת ריכוז הנבגים בהתאם להוראות היצרן באמצעות המוציטומטר. ברגע שריכוז תרחיף הזואוספור ידוע, מדללים את התרחיף לריכוז של 1 x 106 זואוספורים לכל 3 מ"ל עם מי ברז מיושנים.
- חיסון בעלי חיים
- לחסן כל חיה על ידי שפיכת 3 מ"ל של תערובת inoculum על הוונטר שלה במיכלים בודדים 50 מ"ל. יש לאפשר לעודפי החיסון להצטבר לבסיס מיכל החיסון. השאירו כל בעל חיים במיכל חיסון אישי למשך 24 שעות כדי להבטיח זיהום, ולאחר החיסון של 24 שעות, החזירו כל אדם לטרריום שעבר חיטוי.
- יש לחטא את הטרריה בתמיסת אקונומיקה מסחרית בעלת נפח/נפח (v/v) של 13%, לשטוף לפחות פעמיים במים ולאחר מכן לאפשר לייבוש במשך לא פחות מ-24 שעות.
- עבור בקרות Bd שליליות, לחסן את בעלי החיים באותן שיטות כמו 3.2 - 3.3, אך להציף צלחות אגר ללא Bd עם 5 מ"ל של מי ברז מיושנים במקום צלחות אגר מחוסנות Bd.
4. קספז 3/7 Assay
- אספו קצות אצבעות מכל בעל חיים (הן Bd חשוף והן Bd שלילי) פעם בשבוע עד שבוע 3 לאחר החיסון, ושבועיים עד סוף הניסוי, עד 8 אצבעות לאדם.
- חותכים את קצה הבוהן בפלנגות השנייה בעזרת מספריים מעוקרים בלהבה, ומניחים במיקרו-צינור בנפח 1.5 מ"ל, ומקפיאים מיד בטמפרטורה של -80°C.
- חלצו חלבונים מדגימת בוהן קפואה.
- מקם דגימות ב 100 μL של חיץ דגימה (25 mM HEPES pH 7, 5 mM MgCl2) עם שני חרוזי נירוסטה (3.2 מ"מ) במיקרו-צינור מכסה בורג 1.5 מ"ל. ליז דוגם על ידי 4 מחזורים של 1 דקה חרוז מכה במהירות מקסימלית (באותו מקצף חרוזים שבו נעשה שימוש בשלב 1.2.1) ואחריו 3 דקות על קרח. לאחר ליזיס, דגימות צנטריפוגות ב 12,000 x גרם ו 4 ° C במשך 5 דקות. לאסוף supernatant לשימוש בבדיקה.
- כמת את ריכוז החלבון לדגימה באמצעות בדיקת ברדפורד.
- בצלחת של 384 בארות, מערבבים 10 μL של תמצית חלבון עם 10 μL של מגיב ברדפורד, ודגרים במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. בצע כל דגימה בשכפול, יחד עם סדרה של תקני דילול BSA פי 5. קרא את הספיגה ב- 595 ננומטר בקורא לוחות ספיגה.
- לחלופין, אם דגימות קצה הבוהן קטנות מדי (ריכוז החלבון קרוב לתקן הנמוך ביותר כפי שנקבע מבדיקת ברדפורד או אם הצפרדעים שנדגמו הן מתחת למשקל כולל של 3 גרם), יש לתקנן את הדגימות על ידי הערכת שטח הפנים של העור באמצעות צילומים, במקום בדיקת ברדפורד.
- לפני חילוץ החלבונים מהדגימה לבדיקת הקספז, צלמו כל בוהן בהגדלה של פי 40 באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך.
- נתח את דגימת הבוהן באמצעות תוכנת הדמיה ממוחשבת, על ידי הערכת אזור הבוהן. עשה זאת על-ידי ציור קו סביב קצה תפס הבוהן, ובקש מתוכנת ההדמיה להעריך את האזור בתוך הצורה. לאחר מכן הכפל שטח זה ב- pi (3.14), אשר ידמה בקירוב את שטח הפנים של דגימת העור התלת-ממדית (כפי שאורך x שטח חתך (pi x קוטר) נותן את שטח הפנים החיצוני של צינור).
- בצע את בדיקת הקספז 3/7.
- בצלחת זוהרת של 384 בארות, הוסיפו 10 μL של מגיב קספז 3/7 זמין מסחרית ו-10 μL של תמצית חלבון. הפעל כל דגימה בשלשה.
- מערבבים את הריאגנטים על ידי ניעור הצלחת באיטיות במשך 15 שניות. דוגרים על הצלחת הרחק מהאור למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. מדוד עוצמת אור באמצעות קורא לוחות זוהר.
