בדיקת פגוציטוזיס: טכניקה של צביעה חיסונית כדי לדמיין בליעת תאים אפופטוטיים בתאים עובריים של Drosophila melanogaster

תקציר

מקור: Nonaka, S. et al. בדיקת פגוציטוזה לתאים אפופטוטיים בעוברי דרוזופילה. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מדגים טכניקת צביעה חיסונית כדי לדמיין בליעת תאים אפופטוטיים בתאים עובריים הומוגניים של Drosophila melanogaster. שיטה זו מספקת תובנות לגבי הפיזיולוגיה התאית על ידי קביעת מידת הבליעה של תאים אפופטוטיים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. צביעה של המוציטים

1. Immunostaining עם נוגדן anti-Croquemort
   1. יש להשרות באופן סדרתי מגלשות זכוכית במתנול למשך 10 דקות, ב-PBS המכיל 0.2% (v/v) Triton X-100 למשך 10 דקות, ולאחר מכן ב-PBS למשך 10 דקות.
   2. יש להרכיב 20 μL של 5% (v/v) נסיוב חזירים שלם ב-PBS המכיל 0.2% (v/v) Triton X-100 על תאים לחסימה. יש לדגור על מגלשות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
   3. הסר את התמיסה ממגלשות זכוכית, והתקן 20 μL של אנטי-סרום נגד Croquemort (0.1% (v/v)) ב-PBS המכיל 0.2% (v/v) Triton X-100 על תאים. י....

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
סרום חזירים שלם	MP Biomedicals	55993	לחסימה
Kpl נגד חולדות IgG (H+L) Ab MSA, AP	KPL	475-1612	נוגדן משני להמוציטים stainig עם נוגדן anti-Croquemort
5-ברומו-4-כלורו-3-אינדוליל-פוספט	רוש	11383221001	BCIP, להכתמת המוציטים
טטרזוליום כחול ניטרו	רוש	11383213001	NBT, להכתמת המוציטים
נוגדן נגד Croquemort			תואר בעבר ב Manaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit	מיליפור	S7100	עבור צביעה של תאים אפופטואיטים. ערכה זו כוללת מאגר שיווי משקל, מאגר תגובה, מאגר STOP/Wash, אנזים TdT ואנטי-דיגוקסיגנין-פרוקסידאז.
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrichloride	נאקלאי טסק	11009-41	DAB, לצביעה של תאי אפופטוויטק