בדיקת פגוציטוזיס: טכניקה של צביעה חיסונית כדי לדמיין בליעת תאים אפופטוטיים בתאים עובריים של Drosophila melanogaster

תקציר

מקור: Nonaka, S. et al. בדיקת פגוציטוזה לתאים אפופטוטיים בעוברי דרוזופילה. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מדגים טכניקת צביעה חיסונית כדי לדמיין בליעת תאים אפופטוטיים בתאים עובריים הומוגניים של Drosophila melanogaster. שיטה זו מספקת תובנות לגבי הפיזיולוגיה התאית על ידי קביעת מידת הבליעה של תאים אפופטוטיים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. צביעה של המוציטים

1. Immunostaining עם נוגדן anti-Croquemort
   1. יש להשרות באופן סדרתי מגלשות זכוכית במתנול למשך 10 דקות, ב-PBS המכיל 0.2% (v/v) Triton X-100 למשך 10 דקות, ולאחר מכן ב-PBS למשך 10 דקות.
   2. יש להרכיב 20 μL של 5% (v/v) נסיוב חזירים שלם ב-PBS המכיל 0.2% (v/v) Triton X-100 על תאים לחסימה. יש לדגור על מגלשות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
   3. הסר את התמיסה ממגלשות זכוכית, והתקן 20 μL של אנטי-סרום נגד Croquemort (0.1% (v/v)) ב-PBS המכיל 0.2% (v/v) Triton X-100 על תאים. יש לדגור על מגלשות בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
   4. השרו מגלשות זכוכית ב-PBS המכילות 0.2% (v/v) Triton X-100 למשך 10 דקות 5 פעמים.
   5. השרו מגלשות זכוכית ב-PBS למשך 10 דקות.
   6. הר 20 μL של IgG נוגד חולדות אלקליין פוספטאז (0.5% (v/v)) ב- PBS המכיל 0.2% (v/v) Triton X-100 ו- 5% (v/v) נסיוב חזירים שלם על תאים בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
   7. השרו מגלשות זכוכית ב-PBS המכילות 0.2% (v/v) Triton X-100 למשך 10 דקות 5 פעמים.
   8. השרו מגלשות זכוכית במאגר המכיל 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl ו-50 mM MgCl2 למשך 10 דקות.
   9. תמיסת מצע הר פוספטאז המכילה 0.23 מ"ג/מ"ל 5-ברומו-4-כלורו-3-אינדוליל-פוספט (BCIP), 0.35 מ"ג/מ"ל ניטרו כחול טטרזוליום (NBT), 100 מ"מ Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl ו-50 mM MgCl₂ על תאים.
   10. התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ לצביעה נכונה. כאשר אותות סגולים חזקים מופיעים בגרגירים של המוציטים, הסר את תמיסת המצע, והשרה שקופיות זכוכית בחיץ המורכב מ 10 mM Tris-HCl, pH 8.5, ו 1 mM EDTA. מומלץ להכתים במשך כ 5 - 10 דקות.

2. הכתמת תאים אפופטוטיים על ידי טונל

1. השרו מגלשות זכוכית ב-PBS למשך 5 דקות.
2. חזור על הפעולה עם PBS חדש.
3. מאגר שיווי משקל הרכבה (ראה טבלת חומרים) בתאים למשך 10 דקות.
4. הסר את התמיסה ממגלשות זכוכית, והתקן 20 μL של תמיסת TdT המכילה 5 μL של deoxynucleotidyl transferase טרמינלי ו- 15 μL של חיץ תגובה על תאים ב- 37 ° C למשך שעה אחת.
5. הסר את התמיסה ממגלשות זכוכית, והשרה שקופיות במאגר המורכב ממאגר STOP/Wash של 0.5 מ"ל ו- 17 מ"ל מים.
6. השרו שקופיות ב-PBS למשך 5 דקות 3 פעמים.
7. הר 20 μL של אנטי דיגוקסיגנין-פרוקסידז על תאים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
8. השרו מגלשות זכוכית ב- PBS למשך 5 דקות 4 פעמים.
9. השרו מגלשות זכוכית בתמיסת מצע פרוקסידז המורכבת מ-30 מ"ל של 50 מילימטר Tris-HCl, pH7.5 המכילה מרית מיקרו מלאה של 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrichloride (DAB), ו-0.002% (v/v) H₂O₂ עבור 30 שניות.
10. חזור על השלב לעיל עד שתאים אפופטוטיים מוכתמים בחום. השרו את מגלשות הזכוכית במים כדי לעצור את תגובת הפרוקסידז.
11. הקיפו תאים במים לתצפית.

3. למדוד את רמת הפאגוציטוזה של תאים אפופטוטיים

1. צפו בדגימות תחת מיקרוסקופ אור על מנת להעריך את רמת הפאגוציטוזה. ספירת תאים חיוביים לקרוכמורט או תאים חיוביים ל-GFP כהמוציטים, תאים חיוביים לטונל כתאים אפופטוטיים, ותאים חיוביים כפולים כהמוציטים פגוציטוזיים.
2. האינדקס הפאגוציטי מוגדר כמספר התאים החיוביים הכפולים למספר הכולל של תאים חיוביים לקרוקמורט או תאים חיוביים ל-GFP. מומלץ כי יותר מ 300 hemocytes נצפים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
סרום חזירים שלם	MP Biomedicals	55993	לחסימה
Kpl נגד חולדות IgG (H+L) Ab MSA, AP	KPL	475-1612	נוגדן משני להמוציטים stainig עם נוגדן anti-Croquemort
5-ברומו-4-כלורו-3-אינדוליל-פוספט	רוש	11383221001	BCIP, להכתמת המוציטים
טטרזוליום כחול ניטרו	רוש	11383213001	NBT, להכתמת המוציטים
נוגדן נגד Croquemort			תואר בעבר ב Manaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit	מיליפור	S7100	עבור צביעה של תאים אפופטואיטים. ערכה זו כוללת מאגר שיווי משקל, מאגר תגובה, מאגר STOP/Wash, אנזים TdT ואנטי-דיגוקסיגנין-פרוקסידאז.
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrichloride	נאקלאי טסק	11009-41	DAB, לצביעה של תאי אפופטוויטק