בדיקת אפרוציטוזה של תאים קבועים: שיטה לחקר ספיגה אפרוציטית של תאים אפופטוטיים על ידי מקרופאגים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

תקציר

מקור: Taruc, K., et al. Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (2018).

בסרטון זה, אנו מדגימים את בדיקת האפרוציטוזיס כדי לחקור את פינוי התאים האפופטוטיים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. אפרוציטוזה היא תהליך רב-שלבי שבו תאים אפופטוטיים נבלעים על ידי פגוציטים ומתפרקים בתוך שלפוחיות הנקראות אפרוזומים. פרוטוקול זה מספק שיטה לדמיין חלקים מופנמים ולא מופנמים של תאים אפופטוטיים בודדים ולכמת אפרוציטוזה.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. תרבית והכנה של קו תאי מונוציטים THP-1

1. תרבית THP-1 מונוציטים כתרבית השעיה בצלוחיות T25 ב 37 ° C + 5% CO₂. תאים צריכים להיות מגודלים ב 5 מ"ל של Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10% סרום בקר עוברי (FBS).
2. בכל יום, להשעות תאים באופן שווה לאורך מדיה הצמיחה על ידי בעדינות ניעור הצלוחית, ולאחר מכן מיד לספור תאים עם המוציטומטר. יש להעביר תאים ברגע שצפיפות התא מגיעה ל 1 x 10⁶ תאים / מ"ל:
   1. סל"ד חם מראש 1640 + 10% FBS באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
   2. העבר 2 x 10⁵ תאים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל או צינור חרוטי 15 מ"ל, ותאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב 500 x גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
   3. הסר את הסופרנאטנט מבלי להפריע לגלולת התא והשהה מחדש את הגלולה ב -1 מ"ל (צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל) או 5 מ"ל (צינור חרוטי 15 מ"ל) של מלח חוצץ פוספט (PBS).
   4. צנטריפוגה את הצינור ב 500 x גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. להסיר את PBS מבלי להפריע את גלולת התא.
   5. להשעות את הגלולה ב 1 מ"ל של סל"ד טרי 1640 + 10% FBS.
   6. לתוך בקבוק T25 חדש מניחים 4 מ"ל של מדיה מחוממת, ולכך מוסיפים את התאים המרחפים מ-1.2.5. תרבית באינקובטור 37°C + 5% CO₂ עד שהתאים דורשים מעבר (בדרך כלל 3 ימים), או עד שהתאים נדרשים לניסוי.
3. לניסוי עם מקרופאגים שמקורם ב-THP-1, הסירו את מספר התאים הנדרש מהבקבוק ומהצלחת לפני המעבר:
   1. מקם את המספר הנדרש של כיסויי זכוכית עגולים בקוטר 18 מ"מ (עובי #1.5) בבארות של צלחת בת 12 בארות - בדרך כלל 1 כיסוי לכל מצב ו / או נקודת זמן. לתוך כל באר aliquot 5 x 10⁴ מונוציטים THP-1. ניתן לשנות את מספר התאים שנוספו לכל באר במידת הצורך.
   2. העלה את הנפח הכולל של כל תא המכיל באר ל 1 מ"ל באמצעות RPMI + 10% FBS מחומם ל 37 ° C.
   3. הוסף 100 ננומטר פורבול 12-myristate 13-אצטט (PMA) לכל באר ותרבית במשך 3 ימים כדי לגרום להתמיינות של מונוציטים THP-1 לתאים דמויי מקרופאגים.

2. תרבית והכנה של קו תאי המקרופאגים J774.2

1. תרבית J774.2 תאים בצלוחיות T25 ב 37 ° C + 5% CO₂. תאים יש לגדל ב 5 מ"ל של Dulbecco של Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% FBS ולעבור ברגע שהתרבית מגיעה למפגש של 80-90%. כדי לעבור בין תאים:
   1. הסר את כל המדיה מן הבקבוק ולעלות פעם אחת עם 5 מ"ל של PBS.
   2. הסר PBS מהבקבוק והחלף ב 5 מ"ל של DMEM טרי + 10% FBS.
   3. באמצעות מגרד תאים, לגרד את החלק התחתון של הבקבוק כדי להשעות את התאים במדיה. פיפטה נמרצת של התאים מספר פעמים כדי לפרק את כל צברי התא.
   4. לדלל תאים 1: 5 על ידי הסרת 4 מ"ל של תרחיף התא מן הבקבוק והחלפתו עם 4 מ"ל של מדיה טרייה. ניתן להשליך את תרחיף התאים הנותר, להשתמש בו כדי להתחיל תרבית תאים חדשה בצלוחית T25 טרייה, או להשתמש בו לניסוי.
2. כדי להגדיר בדיקת אפרוציטוזה באמצעות תאי J774.2:
   1. יום אחד לפני תחילת הניסוי, השהה תאי J774.2 לתוך 5 מ"ל של מדיה טרייה, לפי שלבים 1.1.1-1.1.3. ספירת תאים באמצעות המוציטומטר והכן את נפח התאים הדרוש בריכוז של 5 x 10⁴ תאים / מ"ל.
   2. מקם את המספר הדרוש של 18 מ"מ עגול זכוכית מכסה (# 1.5 עובי) לתוך בארות של צלחת 12 בארות. לתוך כל באר aliquot 1 מ"ל של 5 x 10⁴ תאים / mL תא השעיה.
   3. תרבית למשך הלילה כדי לאפשר לתאים להיצמד לכיסוי ולהתאושש מהמעבר.

3. תרבית של מקרופאגים אנושיים ראשוניים מסוג M2

1. לאסוף 10 מ"ל של דם אנושי heparinized עבור כל צלחת 12-באר של מקרופאגים M2 נדרש.
2. בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, שכבה 5 מ"ל של דם אנושי על גבי 5 מ"ל של מדיום הפרדת תאי לימפוליט-פולי שחומם מראש. הכינו צינורות מרובים אם אתם מעבדים >5 מ"ל דם במקום להשתמש בצינורות בעלי נפח גדול יותר.
3. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 35 דקות, באמצעות תאוצה בינונית וללא הפסקה.
4. הסר בזהירות את הרצועה העליונה העשירה בתאים מונוגרעיניים באמצעות פיפטור פלסטיק והעבר לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. אם הוכנו צינורות מרובים בשלב 3.2, ניתן לאגד את הפסים לצינור יחיד של 50 מ"ל. להביא נפח של צינור עד 50 מ"ל עם PBS.
5. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 8 דקות ולהסיר את supernatant. במהלך שלב זה הניחו כיסויים עגולים בקוטר 18 מ"מ (עובי #1.5) לכל באר של צלחת 12 בארות.
6. להשעות מחדש את גלולת התא ב 300 μL של RPMI ללא סרום 1640 לכל מספר רצוי של בארות; לדוגמה, אם 10 מ"ל של דם עובדו כדי להכין צלחת מלאה של 12 בארות, להשהות את גלולת התא ב 3.6 מ"ל של מדיה.
7. הוסף 300 μL של תרחיף התא לכל באר המכילה כיסוי בצלחת 12 בארות. יש לדגור במשך שעה אחת ב-37°C + 5% CO₂.
8. יש לשטוף בעדינות את הכיסוי 3x עם 1 מ"ל PBS מחומם כדי להסיר תאים שאינם נדבקים.
9. הוסף 1 מ"ל של RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/mL רקומביננטי אנושי M-CSF + תרבית תאים אנטיביוטיקה / antimycotic. יש לדגור ב-37°C + 5% CO₂ למשך 5 ימים.
10. החלף מדיה ב- RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/mL רקומביננטי אנושי M-CSF + 10 ng/mL רקומביננטי אנושי IL-4 + אנטיביוטיקה / אנטי-מיקוטי בתרבית תאים. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C + 5% CO₂ למשך יומיים כדי להשלים את קיטוב M2.
11. יש להשתמש במקרופאגים מקוטבים במהלך 3 הימים הקרובים.

4. הכנת תאי Jurkat אפופטוטיים

1. תרבית תאי Jurkat ב 5 מ"ל של RPMI 1640 + 10% FBS ב 37 ° C + 5% CO₂. יורקטים הם קו תאי תרחיף וניתן לשמור עליהם על ידי העברת 1:5 למדיה טרייה שחוממה מראש כל 3-5 ימים.
2. כדי להכין תאים אפופטוטיים, לאפשר לתרבית Jurkat לגדול לצפיפות גבוהה (4-5 ימים לאחר המעבר). Aliquot 1.5 מ"ל לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל ותאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות.
3. יש להשליך את גלולת התא supernatant ולהשהות מחדש ב-1 מ"ל של מדיום RPMI 1640 ללא סרום המכיל 1 מיקרומטר staurosporine.
4. לדגור 16 שעות ב 37 ° C + 5% CO₂ כדי להפוך תאים אפופטוטיים.
5. אם תרצה, אשר השראת אפופטוזיס על ידי צביעה עם נספח V:
   1. Aliquot 100 μL של תרבית תאי Jurkat שטופלה staurosporine לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. תאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות, להשליך supernatant, ו re-suspend cell pellet ב 100 μL של סל"ד ללא סרום 1640 בינוני.
   2. הוסף 1 μL של פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) מצומד Annexin V ודגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
   3. הוסף 900 μL של PBS ולהעביר את כל נפח לבאר אחת של צלחת 12 באר המכילה כיסוי זכוכית עגול 18 מ"מ (# 1.5 עובי). סובב מטה בצנטריפוגה המצוידת במתאם לוחות במהירות של 200 x גרם למשך דקה אחת כדי לאלץ את התאים להיצמד לכיסוי. לחלופין, ניתן למקם תאים בשקופית קאמרית לצורך הדמיה.
   4. תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

5. כימות ספיגה ודינמיקה של אפרוציטים באמצעות בדיקת אפרוציטוזה של תאים קבועים וצביעה מבפנים החוצה

1. הכינו מקרופאגים אנושיים מסוג THP-1, J774.2 או M2 כמתואר בסעיפים 1-3, בהתאמה.
2. בערב שלפני תחילת הניסוי, הכינו תאי יורקט אפופטוטיים כמתואר בסעיף 4.
3. מיד לפני הניסוי, לספור תאים אפופטוטיים באמצעות המוציטומטר. מעבירים מספר מספיק של תאים אפופטוטיים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל – בדרך כלל אנו מוסיפים 5 x 10⁵ תאים / באר, מה שמספק יחס מטרה:אפרוציטים של 10:1.
4. תאי Jurkat גלולה על ידי צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ו resuspend ב 500 μL של PBS.
5. במהלך הצנטריפוגה, aliquot 10 μL של DMSO לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל. יש להמיס לתוך DMSO כמות מינימלית של N-hydroxysuccinimidobiotin (NHS-Biotin). 5-10 גבישים (~ 0.005 מ"ג) מספיק.
6. העבר את תרחיף התא האפופטוטי / PBS של 500 μL לצינור המכיל DMSO/NHS-ביוטין. לאחר מכן לדלל צבע מעקב תאים לריכוז המומלץ של היצרן לתוך תרחיף התא אפופטוטי. הקפד לבחור צבע מעקב אחר תאים שאינו חופף ספקטרלית עם FITC-Streptavidin (למשל צבע מעקב אחר תאים אדומים או אדומים רחוקים).
7. יש לדגור על המתלים למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. הוסף נפח שווה של RPMI 1640 + 10% FBS ודגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר בחושך כדי להרוות כל צבע שלא הגיב.
8. תאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות, להשליך את supernatant, ולהשהות מחדש את התאים אפופטוטיים מוכתמים ב 100 μL של RPMI 1640 + 10% FBS לכל באר של מקרופאגים.
9. הוסף 100 μL של תרחיף תאים אפופטוטי מוכתמים טיפה טיפה לכל באר של מקרופאגים. צנטריפוגה 200 x גרם למשך דקה אחת בצנטריפוגה המצוידת במתאם לוחות כדי לכפות מגע בין מקרופאגים לתאים אפופטוטיים.
10. דגירה על צלחת לפרק הזמן הרצוי ב 37 ° C + 5% CO₂ באינקובטור תרבית רקמות. עבור מקרופאגים, חומר efferocytosed הוא בדרך כלל לגילוי הראשון לאחר 20-30 דקות, והוא הושלם לאחר 120-180 דקות.
11. בנקודות הזמן הרצויות מוציאים תאים מהאינקובטור. יש לשטוף תאים פעמיים עם 1 מ"ל PBS בטמפרטורת החדר כדי לעצור אפרוציטוזה ולהסיר תאים אפופטוטיים שאינם אפרוציטוזיים.
12. מוסיפים סטרפטאבידין מצומד FITC בדילול של 1:1,000 לכל באר ודגרים במשך 20 דקות בחושך. פעולה זו תתייג את הביוטין שנחשף על כל חומר תא אפופטוטי שאינו אפרוציטוזי.
    הערה: אם תרצה, גרעיני התא יכולים להיות מוכתמים בשלב זה על ידי תוספת של דילול 1:20,000 של Hoechst 33342 או 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI).
13. יש לשטוף תאים 3 פעמים עם 1 מ"ל PBS, לנער או לנדנד בעדינות את הדגימות במשך 5 דקות לכל שטיפה. תקן תאים עם 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו תאים פעם אחת עם PBS כדי להסיר עודפי PFA.
14. תושבת מכסה על שקופית לצורך הדמיה והעברה למיקרוסקופ פלואורסצנטי. לכוד ערימות z של מספר מספיק של תאים לכימות מדויק - בדרך כלל 10-30 תאים לכל תנאי. חומר תא אפופטוטי שאינו מופנם ייראה בתמונה המתקבלת כחומר בעל תווית צבע למעקב אחר תאים העטוף בצביעת FITC-streptavidin, בעוד שחומר efferocytosed יוצר puncta צבע מעקב תאים בדיד ללא כל צביעת סטרפטווידין.
15. כימות אפרוציטוזה בתמונות המתקבלות באמצעות מגוון אמצעים:
    1. חשב את האינדקס האפרוציטי על ידי קביעת המספר הממוצע של אפרוזומים בדידים (צבע מעקב אחר תאים+/סטרפטווידין- פונקטה) לכל מקרופאג. כמת רק מקרופאגים הקשורים לתא אפופטוטי או מכילים ≥1 אפרוזומים גלויים. רשום מקרופאגים הקשורים לתא אפופטוטי, אך חסרים אפרוזומים בדידים, כבעלי אינדקס אפרוציטי של 0.
    2. חשב יעילות אפרוציטית על ידי מדידת חלק המקרופאגים המכילים ≥1 אפרוזום.
    3. חישוב קצב האפרוציטוזה על ידי תאי הדמיה קבועים ומוכתמים במספר נקודות זמן. רק מקרופאגים דמויים הקשורים לתאים אפופטוטיים, או מכילים אפרוזומים גלויים, עם ערימות z שנלכדו של כל תא. לאחר התמונה, לקבוע את שיעור efferocytosis:
       1. באמצעות צביעת סטרפטאבידין כקו מנחה, וכלי בחירת המצולע או היד החופשית ב- FIJI/ImageJ (או חבילת תוכנה אחרת לניתוח תמונות), הקיפו בעיגול את כל החומר העוקב אחר תאים בצבע +/סטרפטווידין (למשל מופנם) במישור אחד של ערימת z. מדוד את העוצמה המשולבת של צבע מעקב התא באזור זה. ניתן לרכוש בקלות מדדים נפרדים עבור כל אפרוזום (למשל קוטר, מיקום ביחס לגבול התא או הגרעין וכו') במקביל למדידות אלה, מה שמגדיל מאוד את הנתונים שנאספו במהלך הניתוח.
       2. באותו חתך z, תוך שימוש בצביעת סטרפטווידין כקו מנחה ובכלי בחירת המצולע או היד החופשית, הקיפו את כל החומר העוקב אחר תאים בצבע +/סטרפטווידין+ (למשל לא מופנם) במישור אחד של ערימת z. כוללים רק צביעה מתאים אפופטוטיים במגע עם הפאגוציטים. מדוד את העוצמה המשולבת של אזור זה.
       3. חזור על שלבים 4.2.3.1 עד 4.2.3.2 עבור מקטעי z הנותרים של התמונה. סכמו את העוצמה המשולבת של החומרים האפרוציטוזים (Σ_eff) והלא-אפרוציטוזים (Σ_ne). ניתן לחשב את החלק של התא האפופטוטי שעבר efferocytosed עבור התא כ:
          
       4. כמת את השבר efferocytosed עבור כל התאים בכל נקודות הזמן. שימו לב שהעוצמה הפלואורסצנטית של תאים אפופטוטיים/אפרוזומים יכולה להשתנות בין תמונות בשל שינויים בספיגת צבעי מעקב תאים על ידי תאים אפופטוטיים בודדים, ובשל שינויים בפרמטרים של רכישת תמונה כגון זמן חשיפה. לפיכך, יש להשוות רק ערכים מנורמלים כגון Fraction Efferocytosed, או ערכים שאינם תלויים בעוצמה כגון אינדקס efferocytic ויעילות efferocytic, בין תמונות, בין תנאי ניסוי, ובין ניסויים חוזרים.
    4. כדי להבטיח שמערך הנתונים המתקבל משקף במדויק את השונות באפרוציטוזה בין תאים, בצע ניתוחים אלה על מספר התאים המרבי האפשרי בכל ניסוי.
       הערה: יעילות אפרוציטית ואינדקס אפרוציטי ניתנים לחישוב מהיר (מספר שניות לתא), ובדרך כלל אנו שואפים לנתח לפחות 100 תאים בכל ניסוי, ולחזור על כל ניסוי לפחות 3 פעמים. חישוב החלק של חומר efferocytosed, ומדדים ספציפיים efferosome הם מייגעים יותר, בדרך כלל לוקח 2-3 דקות / תא עבור אנליסט מנוסה. עבור חישובים אלה, אנו מכמתים מינימום של 15 תאים לכל תנאי, לכל ניסוי.
    5. רשום אינדקס efferocytic, efferocytosed fraction ונתוני efferosome בודדים על בסיס לכל תא.
       הערה: זה מאפשר ניתוח נתונים באמצעות גישות של תא בודד, ובכך מאפשר לכמת וריאציות בין תאים. עדיין ניתן לבצע ניתוחים ברמת האוכלוסייה על מערכי נתונים אלה על ידי ממוצע נתונים חד-תאיים שנרכשו בניסויים בודדים. מדידות ספציפיות לאפרוזום ניתנות לניתוח ברמת האוכלוסייה, ברמת תא בודד, וכהרכבים (למשל כאוכלוסיות של אפרוזומים ללא תלות בתאים המכילים אותם).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
RPMI 1640 מדיה	וויסנט	3500-000-EL
מדיה DMEM	וויסנט	319-005-CL
סרום בקר עוברי (FBS)	וויסנט	080-150
PBS	וויסנט	311-010-CL
18 מ"מ זכוכית עגולה מכסה מחליקים #1.5 עובי	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	72290-08	גודל וצורת הכיסוי אינם קריטיים, אך 18 מ"מ מתאימים לבארות של צלחת סטנדרטית בת 12 בארות המפשטת את תרבית התאים
סטאורוספורין	קיימן כימיקל	81590	מתמוסס ב-DMSO ב-1 mM (פתרון מלאי פי 1,000)
נספח V-Alexa 488	תרמופישר	₪1000
EZ-Link NHS-ביוטין	תרמופישר	20217	יש לאחסן במייבש. אל תכינו פתרון מלאי.
DMSO	סיגמא-אולדריץ'	D2650
CellTrace FarRed	תרמופישר	C34572
CellTrace כתום	תרמופישר	C34851
Hoescht 33342	תרמופישר	62249
FITC-סטרפטוואדין	תרמופישר	SA1001
מדיום הפרדת תאי לימפוליט-פולי	מעבדות סידרלן	CL5071
M-CSF אנושי רקומביננטי	פפרוטק	200-04
רקומביננטי אנושי IL-4	פפרוטק	300-25
קו תאי מקרופאג J774.2	סיגמא-אולדריץ'	85011428-1VL
קו תאי מונוציטים אנושיים THP-1	ATCC	TIB-202
קו תאי Jurkat T	ATCC	TIB-152