The In Vitro Single Ovcyte Reporter Assay: טכניקה לחקר ויסות תרגום mRNA ממוקד במהלך הבשלת ביציות חוץ גופיות

תקציר

מקור: Costermans, N. G. J. et al., הגדרת התוכנית של תרגום mRNA אימהי במהלך הבשלה חוץ גופית באמצעות בדיקת כתב ביצית יחידה. J. Vis. Exp. (2021).

בסרטון זה אנו מדגימים כי בנוכחות מעכב פוספודיסטר, מחזור תאי הביצית נעצר בשלב I, שבמהלכו מאוחסנים mRNA משועתקים בהיעדר תרגום. לאחר שחרור המעכב, התבגרות הביציות מתחדשת, והתאים נכנסים למטאפאזה. האות של mRNA הכתב התמזג עם גן המטרה במטאפאזה-I מצביע על הפעלת מכונות תרגום וביטוי חלבונים.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הביקורת הווטרינרית JoVE.

1. הכנת מדיה

1. הוסף את כל הרכיבים, כמתואר בטבלה 1, כדי להפוך את מדיום איסוף הביציות הבסיסי למדיום ואת מדיום הבשלת הביציות. עבור אמצעי האיסוף הבסיסי, הגדר את ה- pH ל- 7.4. הן לאיסוף והן למדיום ההתבגרות, יש להוסיף 3 מ"ג/מ"ל אלבומין בסרום בקר (BSA) ו-1 מיקרומטר צילוסטאמיד ביום השימוש.

2. הכנת קידוד mRNA עבור Ypet-3' UTR ו-mCherry

1. השג את רצפי ה-UTR 3′ של ה-mRNA המעניין.
   הערה: במחקר זה, רצפים התקבלו בעבר מ- cDNA של ביצית עכבר.
2. תכננו פריימרים להגברת ה-UTR של המטרה 3' מ-cDNA של ביציות וחלקים מווקטור pcDNA 3.1 המכילים רצף קידוד Ypet, תג V5-epitope ומקדם T7.
3. הגברו באמצעות ערכת DNA פולימראז באיכות גבוהה. הפעל את מוצרי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) על ג'ל כדי לבדוק אם המקטעים הם בגודל הנכון, לחתוך את הפסים, ולחלץ את ה- DNA מהג'ל באמצעות ערכת מיצוי ג'ל בהתאם להוראות היצרן.
4. התיך את קטעי ה- PCR לווקטור באמצעות ערכת שיבוט PCR.
   הערה: שברי PCR הודגרו על קרח במשך 4 שעות כדי להקל על תהליך רקומבינציה יעיל יותר. זאת בניגוד להוראות היצרן, הממליצות על זמן דגירה של 45 דקות בלבד.
5. Transfect PCR מקטעי לתוך 5-α מוכשר Escherichia coli חיידקים.
   1. מוסיפים את התערובת והפלסמיד לחיידקים, ודורים על קרח במשך 30 דקות.
   2. מחממים מזעזעים את התערובת ואת הפלסמיד על ידי הנחת התערובת באמבט מים ב 42 מעלות צלזיוס במשך 45 שניות, ומיד מצננים על קרח במשך 3 דקות.
   3. הוסיפו 500 μL של מרק Super Optimal עם מדיום דיכוי קטבוליט (SOC) ודגרו במשך שעה אחת ב-37°C.
   4. סובבים כלפי מטה ב 7000 × גרם במשך 2 דקות, ולהסיר את רוב supernatant. השהה מחדש וצלחת על צלחת אגר של מרק לוריא (LB) עם אנטיביוטיקה מתאימה לבחירה.
      הערה: במחקר זה נעשה שימוש בקרבניצילין.
   5. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C. בודדו את המושבות על ידי לחיצה קלה על קצה פיפטה על אחת המושבות והכנסתו ל-3 מ"ל LB בינוני עם 100 מיקרוגרם/מ"ל קרבניצלין. לדגור במשך 12-24 שעות ב 37 ° C.
   6. יש לחלץ את הדנ"א של הפלסמידים באמצעות ערכת בידוד הדנ"א של הפלסמיד בהתאם להוראות היצרן ולאשר את הרצפים באמצעות ריצוף DNA.
6. עבור Ypet/3' UTR:
   1. הפק תבנית PCR ליניארית לתמלול חוץ גופי. השתמשו בפריימר קדמי במעלה הזרם של רצף Ypet ובפריימר הפוך עם 20 שאריות תימין נוספות. ראה טבלה 2 עבור הרצף של Ypet/IL-7 3' UTR והרצפים של הפריימרים קדימה ואחורה.
      הערה: שאריות תימין נוספות אלה יוסיפו אוליגו (A) ל-mRNA הליניארי לאחר שעתוק במבחנה.
   2. תמלול חוץ גופי של מוצר ה-PCR באמצעות ערכת תמלול T7 בהתאם להוראות היצרן.
   3. לטהר את הרנ"א המשלים (cRNA) המתקבל באמצעות ערכת ניקוי שעתוק בהתאם להוראות היצרן.
   4. יש להאיר את ה-cRNA המטוהר במים נטולי RNAse, למדוד ריכוז ולהעריך את שלמותו על ידי אלקטרופורזה של אגרוז. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C.
7. עבור mCherry:
   1. הפק תבנית PCR ליניארית עבור שעתוק חוץ גופי באמצעות אנזים הגבלה באיכות גבוהה; השתמש באנזים ההגבלה mfEI-HF אם אתה משכפל דוגמה זו. יש לעכל במאגר עיכול למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C.
   2. הפעל ג'ל כדי לטהר את הדגימה, ולחלץ את ה- DNA הליניארי באמצעות ערכת מיצוי ג'ל בהתאם להוראות היצרן.
   3. תמלול חוץ גופי של מוצר ה-PCR באמצעות ערכת תמלול T7 בהתאם להוראות היצרן.
   4. פוליאדנילט את ה-cRNA (150-200 נוקלאוטידים) באמצעות ערכת זנב פולי(A) בהתאם להוראות היצרן.
   5. לטהר את ה-cRNA שנוצר באמצעות ערכת ניקוי תמלול בהתאם להוראות היצרן.
   6. יש לבודד את ה-cRNA המטוהר במים נטולי RNAse, למדוד ריכוזי mRNA ולהעריך את שלמות ההודעה באמצעות אלקטרופורזה בג'ל. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C.

3. הליך ניסיוני

הערה: סקירה סכמטית של מיקרו-הזרקת ביציות ומיקרוסקופ בהילוך מהיר לאחר מכן מוצגת באיור 1.

1. יום 1
   1. הזרקה תוך צפקית לעכברים בני 21 יום 5 IU של גונדוטרופין בסרום של סוסה בהריון כדי לקדם את צמיחת הזקיקים לשלב האנטראלי.
2. יום 3
   1. אוסף ביציות
      1. פתח בזהירות את הזקיקים האנטרליים על ידי ביצוע חתך קטן בדופן הזקיק עם מחט 26 גרם. בודדו ביציות שלמות מוקפות קומולוס (COC) עם מספר שכבות של תאי קומולוס באמצעות פיפטה זכוכית המופעלת על ידי הפה.
      2. השתמש פיפטה קטנה יותר (מעט גדולה יותר מקוטר הביצית), ודחה מכנית את COC על ידי pipetting חוזר.
         הערה: לחלופין, בצע מיקרו-הזרקה על COC שלם.
      3. בעזרת פיפטה גדולה יותר, שואפים את הביציות הדחוסות ומניחים אותן בצלחת פטרי עם מדיום התבגרות בתוספת 1 מיקרומטר של מעכב פוספודיאסטראז, cilostamide, כדי למנוע את חידוש ההתבגרות המיוטית. הניחו את המנה באינקובטור למשך שעתיים כדי לאפשר לביציות להתאושש מהלחץ הנגרם על ידי בידוד הביציות מהזקיקים.
   2. מיקרו-הזרקת ביציות
      1. הכינו את מחטי ההזרקה על ידי הנחת צינור נימי זכוכית בורוסיליקט באורך 10 ס"מ במושך מכני. להזרקה אופטימלית, כופפו את קצה המחט בזווית של 45° באמצעות חוט להט מחומם.
      2. הכינו צלחות פוליסטירן עם 20 μL טיפות של מדיום איסוף ביציות בסיסי, וכסו את הטיפות בשמן מינרלי קל.
      3. הכינו תערובת כתבים על ידי הוספת 12.5 מיקרוגרם/μL Ypet-3' UTR ו-12.5 מיקרוגרם/μL mCherry. הכינו נפח גדול יותר והכינו אליציטוטים לניסויים עתידיים כדי להבטיח ריכוזי כתבים דומים. לאחסן aliquots אלה ב -80 °C. עם ההפשרה, צנטריפוגה ראשונה את aliquot במשך 2 דקות ב 20,000 x גרם, ולהעביר צינור microcentrifuge חדש.
         הערה: צנטריפוגה זו תמנע ממחט ההזרקה להיסתם על ידי אגרגטים פוטנציאליים בתמהיל הכתב.
      4. לטעון את מחט ההזרקה על ידי נימים עם כ 0.5 μL של תערובת כתב.
      5. הניחו את פיפטת האחיזה ומחט ההזרקה הטעונה לתוך המחזיקים, ומקמו בטיפה של מדיום איסוף הביציות. שאפו חלק מהמדיום לתוך פיפטת האחיזה.
      6. פתח את מחט ההזרקה על ידי הקשה עדינה על פיפטה מחזיק.
      7. מניחים ביציות בטיפה של מדיום איסוף בסיסי, ומזריקים 5-10 pL של תערובת הכתב.
      8. לדגור על הביציות בתווך ההבשלה עם 1 μM cilostamide במשך 16 שעות כדי לאפשר את אות mCherry למישור.
      9. הכינו צלחת פטרי שתשמש למיקרוסקופ בהילוך מהיר עם לפחות שתי טיפות 20 μL של מדיום הבשלה לכל כתב מוזרק: טיפה אחת עם 1 μM cilostamide עבור ביציות שלב I מבוקרות וטיפה אחת ללא cilostamide להבשלת ביציות. מכסים את הטיפות בשמן מינרלי קל ומניחים באינקובטור.
   3. מיקרוסקופ קיטועי זמן
      1. לאחר טרום הדגירה, מוציאים את הביציות המוזרקות מהאינקובטור, ושוטפים אותן ארבע פעמים במדיום הבשלה ללא צילוסטאמיד. שמור כמה ביציות במדיום הבשלה עם 1 μM cilostamide כקבוצת ביקורת ביציות שלב I.
      2. העבירו את הביציות המוזרקות לטיפות המתאימות שלהן בצלחת המיקרוסקופ שהוכנה קודם לכן. מקבצים את הביציות באמצעות פיפטה סגורה מזכוכית (ניתן להכין פיפטה סגורה על ידי החזקת הקצה בלהבה למשך מספר שניות).
         הערה: קיבוץ הביציות מסייע למנוע את תנועתן במהלך ההקלטה.
      3. הניחו את הצלחת מתחת למיקרוסקופ המצויד במערכת תאורת דיודות פולטת אור ובבמה ממונעת המצוידת בתא סביבתי המתוחזק בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂. כדי לשכפל מחקר זה, השתמש בפרמטרים הבאים: ערכת סינון: מראה דיכרואית YFP/CFP/mCherry 69008BS; ערוץ YFP (לדוגמה): S500/20 × 49057; פליטה (EM): D535/30 m 47281), ערוץ mCherry (לדוגמה: 580/25 × 49829; שם: 632/60 מ').
      4. הזן את ההגדרות המתאימות עבור ניסוי קיטועי הזמן (ראה טבלת חומרים עבור התוכנה ששימשה במחקר זה): לחץ על אפליקציות | רכישה רב מימדית. בחר בכרטיסיה הראשונה ראשי ובחר קיטועי זמן, מיקומי שלבים מרובים ואורכי גל מרובים.
      5. בחר בכרטיסיה שמירה כדי להזין את המיקום שבו יש לשמור את הניסוי.
      6. בחר בכרטיסיה קיטועי זמן כדי להזין את מספר נקודות הזמן, משך הזמן ומרווח הזמן.
         הערה: משך הניסוי תלוי במיני בעלי החיים שנחקרו, שכן עיתוי ההבשלה המיאוטית של הביציות שונה בין המינים. בניסוי זה עם ביציות עכבר, הביציות נרשמו כל 15 דקות במשך 16 שעות.
      7. בחר את הכרטיסיה Stage. הפעל את brightfield ואתר את מיקום הביציות על ידי פתיחת חלון חדש על ידי בחירה באפשרות רכוש | רכישה | הצג בשידור חי. לאחר איתור הביציות, חזור לחלון הרכישה הרב-ממדית ולחץ על + כדי להגדיר את מיקום הביציות.
      8. בחר את הכרטיסייה אורכי גל והגדר 3 אורכי גל שונים עבור brightfield (חשיפה של 15ms), YFP (חשיפה של 150ms עבור Ypet/IL7 3' UTR) ו- mCherry (חשיפה של 75ms עבור Ypet/IL7 3' UTR).
         הערה: התאימו את החשיפה לכל כתב UTR Ypet/3' בהתאם לרמת צבירת הכתבים והנפח המוזרק. ודא שאות YFP נמצא במרכז טווח הגילוי בתחילת הניסוי כדי למנוע הערכת חסר או רוויה במקרה של הפעלת תרגום. עבור mCherry, התאם את החשיפה עבור כל אצווה של mCherry כמו האות תלוי במספר נוקלאוטידים אדנין שנוספו במהלך הליך polyadenylation. בגלל השונות ביעילות הפוליאדנילציה, השתמש באותה אצווה של mCherry בניסויים שונים להשוואה טובה יותר בין ניסויים.
      9. התחל את ניסוי קיטועי הזמן על ידי לחיצה על רכישה. ראו איור 1 דוגמה לרישום בהילוך מהיר בביצית יחידה.
   4. ניתוח תרגום Ypet-3' UTR
      1. לצורך ניתוח זה (ראה טבלת חומרים עבור התוכנה ששימשה במחקר זה), בצע שתי מדידות אזור עבור כל ביצית: הביצית עצמה - לחץ על אזור האליפסה והקף את הביצית - ואזור קטן קרוב לביצית שישמש לחיסור רקע - לחץ על אזור מלבני.
         הערה: ודא שהביציות אינן זזות החוצה מהאזור שנבחר במהלך רישום קיטועי הזמן. שימו לב במיוחד למיקום מדידת האזור סביב שחול גוף הקוטב, שכן הדבר גורם לתנועה בביצית ועלול לעוות את ההקלטה.
      2. יצא את נתוני מדידת האזור לגיליון אלקטרוני על-ידי לחיצה תחילה על פתח יומן ולאחר מכן על נתוני יומן כדי לייצא את תוכנת ניתוח הנתונים.
      3. עבור כל ביצית בודדת ועבור כל נקודות הזמן הנמדדות, הפחיתו את מדידת אזור הרקע ממדידת אזור הביציות. עשו זאת עבור אורכי גל YFP ו-mCherry בנפרד.

טבלה 1: הכנת מדיה. רשימת רכיבים שיש להוסיף להכנת מדיום איסוף ביציות בסיסי ומדיום הבשלת ביציות.

מדיום איסוף ביציות בסיסי
רכיב	עבור 500 מ"ל
HEPES שונה מינימום חיוני בינוני איגל	7.1 גרם
סודיום ביקרבונט	252 מ"ג
נתרן פירובט	1.15 מ"ל
פניצילין/סטרפטומיצין 100x	5 מ"ל
מים מזוקקים טהורים במיוחד (Invitrogen, 10977-015)	עד 500 מ"ל
מדיום התבגרות
רכיב	עבור 500 מ"ל
MEM אלפא 1x	עד 500 מ"ל
נתרן פירובט	1.15 מ"ל
פניצילין/סטרפטומיצין 100x	5 מ"ל

טבלה 2: דוגמה לרצפי כתב ופריימר רצף של כתב YFP/IL7 3'UTR ורצפים של פריימרים קדימה ואחורה ששימשו ליצירת תבנית PCR ליניארית לתמלול חוץ גופי.

	רצף
Ypet/אינטרלוקין-7 3' UTR	GAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAAGGCGAAGAGCTGTTCACC GGCGTGGTGCCCATCCTGGTGGAGCTGGACGGCGACGGCCACAAGTTCAGCGTGAGCGGCGAGGGCGAGGGGGCGACACCTACGGCAAGCTGACCCTGACCCTGAAGCTGCTGTGCACCACCGGCAAGCTG CCCGTGCCCTGGCCCACCCTGGTGACCACCCTGGGCTCGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGGTACCCCGACCACATGAAGCAGCACACTTCTTCAAGAGCCCATGCCCGAGGGCTACGTGCAGGAGCGGACCA TCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGGGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGGATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGCAACATCCTGGGCCACAAGCTGGAG TACAACTACAACAGCCACAACGTGTACATCACCGCCGACAAGAGAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGATCCGGCAACATCGAGGACGGCGGCGTGCAGCCTGGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCA TCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGAGCGCCCTGTTCAAGGACCCCAACGAAGCGGGACCACATGGTGCTGGGAGTTCCTGACCGCCGCCGGCATCACCGAGGGC ATGAACGAGCTCTATAAGAGATCTTTCGAAGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCCTCGGTCTCGATTCTACGCGTACCGGTCATCATCACCATCACCATTGAACAGCATGTAGTAACAACCTCCAAGAATCTACTGGTT CATATACTTGGAGAGGTTGAAACCCTTCCAGAAGTTCCTGGATGCCTCCTGCTCAAATAAGCCAAGCAGCTGAGAAATCTACAGTGAGGTATGAGATGATGGACACAAATGCAGCTGCTGCTGCCGTCAGCATATA CATATAAAGATATATCAACTATACAGATTTTTGTAATGCAATCATGTCAACTGCAATGCTTTTAAAACCGTTCCAAATGTTTCTAACACTACAAAGTCTACAAAGCAAGGCTATGATTCAGAGTCACCACTGTTTTT AGCAAAATGATGGTATGGTTAAACATTCATTGGTGAACCACTGGGAGTGGAACTGTCCTGTTTTAGACTGGAGATACTGGAGGGCTCACGGTGATGATATAATGCTCTTGAAAACAAGAGTCTATCTTAAAGCAGCAGCAG CAAAAAGAAGCTTAAGGCACTTAAGGCATCAACAAATGTAGTTAAATATGAATGTATAACACATAACTTCAGTAAAGAGCATAGCATAGCAGATATTATTTTTAAATAAAAGTATTTTTAAAGATAGAAATGCACTTATTCCAAAGATACTGA ACCTTAGTATTCAGTCGCTTTTGACACTTGTGTATAAAGCTTATATAACTGAATTTTCAATTTGAAAAGTATATTATTTAAAAGAATAATATATGCTAGACTTTTAATATTATTATTTTTTGGCATTCTGTCTCT CTGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTACCTATTATTATATATATATAATTTTCATATACTACCAATTGCGTACTTTGGATAGTGTCTCTTTTTAACCTAAATGACCTTTATTAACACTGTCAGGTTCCCTTACTCTCGAGAG TGTTCATTGCTGCACTGTCATTTGATCCCAGTTTTTGAACACATATCCTTTAACACACTCACGTCCAGATTTAGCAGGAGACTAGGACCCTATAACTTTGTTAAGAGAGAACTAATTTTTTTTGTTTTATAGTAGGGTC TTATTCGTATCTAAGGCAGGCTAGGATTGCAGACATGAGCCAATATGCTTAATTAGAAACATTCTTTTTTGTTAAACTCATGTCTTTTACAAGATGCCTACATATATCCTATTATATGCCTGTTTAAATCCTTTTTTGTAAGGT CTGCTGTCTTCCTTCAGTTGTAATGGAAAGAAACACTATGTGTAGAGGCCAAATTTGGAÄGTGATAAGGGTTTGCTTGCTTGTTGTTCTCCTTGTTTTTTCCAGCCACGGCATCTAGCTATCTATACGCT GGATGTATTTGACCGATGCCTGCTCCACTGGCACATTGCATGTGTGGTAGCCATGCCTTCTTGCTTCTCTCTCCCCAACCCCTAATGCTCTACTCAGTGGTACAGATAGCTGGGATTATCAATTTTGAGAGAAAC ACCAATTGTTTAAAGTTTGTTTCATAATCACCATTTGCCCAGAAAACAGTTCTCAACTTGTGTGCAACATGTAATAATTTAAGAAACTCAATTTTTTGTTAATGGACTTTCGATAACTTCCTTAGATATCCCACATCTCCTACGT GTCAGTCCTTTGTCCTGAGGAACTGGTAAAATGGGTAAGCCCTTAGCTAGCGAACTGAAGGCATTCGCATGTGTAAGATAATCTCTATACCTGCAAGGCTGTGGATGGCTCCCTACCAATATTGAACAATATTCTGATT TTGGCAAAATAAAGGATAATATTTT
פריימר קדימה	GAGAACCCACTGCTTAC
פריימר הפוך	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAATATTATTATCCTTTATTTTGCCAAAATC

תוצאות

איור 1: דוגמה לרישום בודד של ביצית בהילוך מהיר. הקלטות Brightfield, YFP ו-mCherry של ביצית בודדת שהוזרקה עם mRNA המקודד Ypet/Interleukin-7 3' UTR ו-mCherry פוליאדנילציה בשלב I, MI (6 שעות לאחר שחרור cilostamide) ו-MII (15 שעות לאחר שחרור cilostamide). סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. קיצורים: YFP = חלבון פלואורסצנטי צהוב; GV = שלפוחית נבט; MI = metaphase I; MII = מטאפאזה II.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
הכנת מדיה
אבקת אלבומין בסרום בקר Bioxtra	סיגמא-אולדריץ'	SIAL-A3311
צ'ילוסטמיד	EMD Millipore	231085
MEM אלפא	גיבקו	12561-056
מינימום חיוני עיט בינוני	סיגמא-אולדריץ'	M2645
פניצילין-סטרפטומיצין 100x פתרון, סטרילי מסונן	תאגיד מדעי ג'נסי (GenClone)	25-512
סודיום ביקרבונט	ג'יי.טי-בייקר	3506-1
נתרן פירובט	גיבקו	11360-070
מים מזוקקים טהורים במיוחד	Invitrogen	10977-015
הכנת קידוד mRNA YFP/3' UTR ו-mCherry
אגרוז	אייפקס ביומדיקל	20-102QD
מלח דיסודיום קרבניצלין	סיגמא-אולדריץ'	C1389-1G
ערכת שיבוט צ'ו-צ'ו	מקלאב	CCK-20
מאגר CutSmart (פי 10)	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	B7204
צבע טעינת DNA (6x)	תרמו סיינטיפיק	₪0611
פתרון dNTP	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	N0447S
צרפת	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	₪2176
GeneRuler 1 kb סולם DNA	תרמו פישר	SM1333
צלחות אגר LB עם 100 מיקרוגרם/מ"ל Carbenicillin, Teknova	טקנובה	L1010
LB בינוני (כמוסות)	MP Biomedicals	3002-021
ערכת ניקוי תמלול MEGAclear	לייף טכנולוגיות	AM1908
אנזים הגבלת MfeI-HF	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	₪799
ערכת תמלול mMESSAGE mMACHINE T7	Invitrogen	AM1344
Phusion DNA פולימראז באיכות גבוהה	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	M0530
ערכת זנב Poly(A)	Invitrogen	AM1350
ערכת מיני-הכנה לספין QIAprep	קיאגן	27106
ערכת מיצוי ג'ל QIAquick	קיאגן	28704
S.O.C. בינוני	תרמו פישר	15544034
מאגר TAE	אייפקס ביומדיקל	20-193
תמיסת אתידיום ברומיד טהורה	לייף טכנולוגיות	15585011
אוסף ביציות
הרכבת צינור שאיפה למיקרו-פיפטות מכוילות	סיגמא-אולדריץ'	A5177-5EA
מיקרו-פיפטות מכוילות	דרמונד סיינטיפיק קומפני	2-000-025
PMSG- 5000	Mybiosource	MBS142665
מחט PrecisionGlide 26 גרם x 1/2	ב.ד.	305111
מזרק 1 מ"ל	ב.ד.	309659
מיקרו-הזרקת ביציות
צלחת 35 מ"מ | מס' 0 כריכה | קוטר זכוכית 20 מ"מ | לא מצופה	מאטק	P35G-0-20-C	למיקרוסקופ בהילוך מהיר
זכוכית בורוסיליקט עם נימה	סאטר אינסטרומנט	BF100-78-10
שמן לתרבית עוברים	אירווין סיינטיפיק	9305
צלחת פטרי	בז	351006	למיקרו-הזרקה
צלחת תרבית רקמות	בז	353001	לדגירה של ביציות
VacuTip מחזיק נימים	אפנדורף	5195000036
תוכנה
Biorender	BioRender		הכנת איור 1S
MetaMorph, גרסה 7.8.13.0	התקנים מולקולריים		למיקרוסקופ בהילוך מהיר, ניתוח תרגום UTR 3'

במיוחד