בדיקת ניטור החמצת מעיים: טכניקה לחקר החמצת לומן המעי בדרוזופילה באמצעות צבע כחול ברומופנול

תקציר

מקור: Abu, F., et al. ניטור החמצת המעי במעי דרוזופילה בוגר. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מדגים בדיקה לניטור החמצת המעי בזבובי דרוזופילה. לאחר בליעה של מזון בתוספת צבע מחוון pH, החמצה של לומן המעי גורם לשינוי בצבע של צבע. בדיקה ויזואלית של מערכת העיכול של הזבובים כדי לבחון את שינוי הצבע מספקת עדות להחמצה.

פרוטוקול

הערה: קו המעבדה הסטנדרטי אורגון R שימש כבקרת WT. כל הזבובים גודלו על מדבשת קמח תירס סטנדרטית (המכילה מולסה, אגר, שמרים, קמח תירס, טגוזפט, חומצה פרופיונית ומים) בטמפרטורת החדר עם שעון ביולוגי בהיר/כהה של 12/12 שעות.

1. הכנה לבדיקה

1. אספו נקבות זבובים (בנות 0-2 ימים, לא בתוליות) תחת הרדמה_CO2 ואפשרו להן להתאושש ממזון רגיל מקמח תירס לפחות 3 ימים לפני הניסויים.
2. הרעיבו את הזבובים במשך ~ 24 שעות בטמפרטורת החדר (~ 23 מעלות צלזיוס) בבקבוקונים המכילים רקמת מגבון מעבדה ספוגה ב~ 2 מ"ל של מים נטולי יונים.
3. הכינו את מזון הזבובים עם ברומופנול כחול (BPB) כדלקמן:
   1. המיסו את מזון הזבובים במיקרוגל ואז תנו לו להתקרר עד שהוא פושר.
   2. מוסיפים 1 מ"ל של 4% BPB ל-1 מ"ל של מזון פושר ומערבבים היטב.
   3. בעזרת פיפט, מוסיפים את מזון הזבובים המכיל BPB לנקודה אחת (~200 μL) במרכז צלחת פטרי.

2. בדיקת ניטור החמצת מעיים

1. העבירו זבובים מורעבים לצלחת פטרי המכילה נקודות בודדות (200 מיקרוליטר) של מזון זבובים בתוספת 2% ברומופנול כחול (BPB). אפשרו לזבובים לחפש מזון במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר כשהם חשופים לאור.
2. לאחר 4 שעות, לאסוף את הזבובים להרדים אותם על קרח; כירורגית לבודד את המעיים שלהם.
   1. בצע את הניתוח במי מלח חוצצי פוספט 1x (PBS) עם מלקחיים תחת סטריאומיקרוסקופ (ראה טבלת חומרים). בודדו את המעי על ידי החזקת בית החזה עם זוג מלקחיים ומשכו את הבטן כלפי מטה עם זוג שני עד שה-CCR של המעי גלוי, תוך הקפדה על כך שהמעי יישאר מחובר בשני קצותיו.
3. קבעו את החמצת המעי על-ידי בחינת צבע ה-CCR של המעי (איור 1C; צהוב מציין חומצה, וכחול מציין לא חומצי).
4. ספרו רק את הזבובים שמראים צביעת BPB חזקה במעיים שלהם.
5. חישוב האחוזים באמצעות המשוואה הבאה:
   אחוז הזבובים עם מעיים חומציים = מספר זבובים מחומצים × 100 / (מספר זבובים מחומצים + מספר זבובים לא חומציים)
   הערה: אחוז של 0 מציין שאף זבוב לא החמיץ, ואילו אחוז של 100 מציין שכל הזבובים החמידו את המעיים שלהם.

תוצאות

איור 1: ניטור החמצת מעיים.(א) שרטוט סכמטי של זירת האכלה. הנקודה הכחולה מייצגת מזון זבובים עם ברומופנול כחול (צבע המציין pH). כתמים אחרים מייצגים זבובי פירות. (B) ייצוג גרפי של אחוז הזבובים המראים החמצת מעיים שניזונו לפרקי זמן שונים במשך 4 שעות. תמונות מעיים מייצגות של מעי חומצי ומעי לא חומצי. החץ האדום מצביע על שחרור חומצי באזור תאי הנחושת של המעי האמצעי. n ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ברומופנול כחול	סיגמא-אולדריץ'		B0126
ד. סימולנים	מרכז מלאי מיני דרוזופילה באוניברסיטת קליפורניה		ריברסייד, קליפורניה1 (https://www.drosophilaspecies.com/)
ד. ארקטה	מרכז מלאי מיני דרוזופילה באוניברסיטת קליפורניה		Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/)
ד. פסאודובסקורה	מרכז מלאי מיני דרוזופילה באוניברסיטת קליפורניה		יוג'ין, אורגון(https://www.drosophilaspecies.com/)
ד. מוג'בנסיס	מרכז מלאי מיני דרוזופילה באוניברסיטת קליפורניה		הרי שוקולד, קליפורניה (https://www.drosophilaspecies.com/)
מלקחיים	אינוקס ביולוגיה		קטלוג# 11252-20
קים מנגבת טישו	קימטק
אורגון ר	מניית בלומינגטון דרוזופילה		(https://bdsc.indiana.edu/ # 2376)
צלחות פטרי	פישר סיינטיפיק		קטלוג #FB0875713A
מלח חוצץ פוספט (PBS)	הייקלון		קטלוג # SH30258.01
סטריאומיקרוסקופ	אולימפוס SZ51		הגדלה חזותית