בדיקת ספיגת סידן מיטוכונדריאלי: שיטה מבוססת קורא צלחות למדידת ספיגת סידן במיטוכונדריה מבודדים

תקציר

מקור: Maxwell, J.T., et al., ניתוחים של זרימת סידן מיטוכונדריאלי במיטוכונדריה מבודדים ובתאים בתרבית. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מתאר בדיקה מבוססת קורא צלחות למדידת ספיגת סידן מיטוכונדריאלי במיטוכונדריה מבודדת. הבדיקה מנתחת את האות הפלואורסצנטי של צבע פלואורסצנטי רגיש לסידן כדי לחקור את הקינטיקה של ספיגת סידן במיטוכונדריה ועומס יתר של סידן.

פרוטוקול

1. ריאגנטים ופתרונות

1. ייצור 500 מ"ל של מאגר MS-EGTA לבידוד מיטוכונדריאלי: 225 מילימטר מניטול, 75 מ"מ סוכרוז, 5 מ"מ 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזיןאתאן-חומצה סולפונית (HEPES), 1 מ"מ אתילן גליקול-ביס(β-אתר אמינואתיל)-N,N,N',N',N'-חומצה טטראצטית (EGTA), pH מותאם ל-7.4 עם KOH. יש לעקר אותו דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר ולאחסן אותו בטמפרטורה של 4°C. ודא שמאגר MS-EGTA מקורר מראש ל-4°C לפני השימוש.
2. הכן 100 מ"ל של מאגר KCl: 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM KH₂PO₄, 2 mM MgCl₂, 40 μM EGTA ו- pH מותאמים ל- 7.2 עם KOH. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
3. הכינו 1 mM סידן ירוק-5N ציר dimethyl sulfoxide (DMSO). ניתן לאזן את מלאי הסידן הירוק....

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קורא מיקרו-צלחות Synergy Neo2 Multimode עם מזרקים	ביוטק
הומוגנייזר רקמות	קימבל	886000-0022
צלחת 96 באר	קורנינג	3628
סידן ירוק-5N	Invitrogen	C3737
DMSO	Invitrogen	D12345
HEPES	סיגמא	H3375
EGTA	סיגמא	E8145
אשלגן כלורי	פישר	BP366-500
מגנזיום כלורי	סיגמא	M2670
נתרן פירובט	סיגמא	עמ' 2256
חומצה L-מאלית	סיגמא	M1125
סידן כלורי	סיגמא	C4901
אשלגן פוספט מונובייסיק	סיגמא	P0662