בדיקת ספיגת סידן מיטוכונדריאלי: שיטה מבוססת קורא צלחות למדידת ספיגת סידן במיטוכונדריה מבודדים

Abstract

מקור: Maxwell, J.T., et al., ניתוחים של זרימת סידן מיטוכונדריאלי במיטוכונדריה מבודדים ובתאים בתרבית. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מתאר בדיקה מבוססת קורא צלחות למדידת ספיגת סידן מיטוכונדריאלי במיטוכונדריה מבודדת. הבדיקה מנתחת את האות הפלואורסצנטי של צבע פלואורסצנטי רגיש לסידן כדי לחקור את הקינטיקה של ספיגת סידן במיטוכונדריה ועומס יתר של סידן.

Protocol

1. ריאגנטים ופתרונות

1. ייצור 500 מ"ל של מאגר MS-EGTA לבידוד מיטוכונדריאלי: 225 מילימטר מניטול, 75 מ"מ סוכרוז, 5 מ"מ 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזיןאתאן-חומצה סולפונית (HEPES), 1 מ"מ אתילן גליקול-ביס(β-אתר אמינואתיל)-N,N,N',N',N'-חומצה טטראצטית (EGTA), pH מותאם ל-7.4 עם KOH. יש לעקר אותו דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר ולאחסן אותו בטמפרטורה של 4°C. ודא שמאגר MS-EGTA מקורר מראש ל-4°C לפני השימוש.
2. הכן 100 מ"ל של מאגר KCl: 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM KH₂PO₄, 2 mM MgCl₂, 40 μM EGTA ו- pH מותאמים ל- 7.2 עם KOH. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
3. הכינו 1 mM סידן ירוק-5N ציר dimethyl sulfoxide (DMSO). ניתן לאזן את מלאי הסידן הירוק-5N ולאחסן אותו בטמפרטורה של -20°C.
4. הכינו מצעים לקליטת Ca²⁺.
   1. להכין 1 M פירובט נתרן, pH 7.4. לאחסן אותו aliquots ב -20 °C.
   2. הכינו 500 mM malate, pH 7.4. לאחסן אותו aliquots ב -20 °C.

2. בידוד מיטוכונדריה לבבית

1. הרדימו את העכבר על פי תקנים מוסדיים.
   הערה: עבור השיטה המאושרת שלנו להמתת חסד, עכברים הורדמו על ידי שאיפת איזופלואורן והוקרבו על ידי פריקת צוואר הרחם.
2. לאסוף את הלב על ידי פתיחת חלל החזה, חיתוך לאורך כל צד של הצלעות, איגוף הלב, חיתוך הסרעפת, וכריתת רקמת הלב.
   הערה: בפרוטוקול זה, בידוד מיטוכונדריאלי מתבצע מלב שלם שנאסף מעכבר בוגר (כ-120 מ"ג), מה שאמור להספיק ל-3-4 ניסויים. לבידוד מיטוכונדריאלי מרקמות עשירות במיטוכונדריה אחרות כגון הכבד, ניתן להשתמש בעד 200 מ"ג רקמה בהתאם לפרוטוקול המתואר.
3. שטפו את הרקמה ביסודיות ב-25 מ"ל של מלח חוצץ פוספט 1x קר כקרח (PBS) וודאו שכל הדם נסחט מהחדרים.
   הערה: הלב יהיה שטוף מספיק כאשר הנוזל סחוט מתוך הלב פועל צלול.
4. טחנו את הלב לחתיכות קטנות ב-5 מ"ל של PBS 1x קר כקרח באמצעות זוג מספריים חדים.
5. יש להשליך את ה-PBS ולהעביר רקמת לב טחונה לזכוכית טפלון מצוננת מראש בגודל 7 מ"ל עם מרווח של 0.10 עד 0.15 מ"מ.
6. הוסף 5 מ"ל של מאגר MS-EGTA קר כקרח, והפוך את הדגימה להומוגנית עד שחלקי הרקמה אינם נראים עוד (כ -11 פעימות).
   הערה: אין ליצור הומוגניות יתר על המידה ברקמה, שכן המטרה היא להשיג מיטוכונדריה שלמה ומתפקדת.
7. מעבירים את ההומוגנאט לצינור של 15 מ"ל.
8. צנטריפוגה הומוגנט ב 600 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות כדי גרעיני גלולה ותאים שבורים.
9. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור טרי של 15 מ"ל וצנטריפוגות אותו בטמפרטורה של 10,000 x גרם ב-4°C למשך 10 דקות למיטוכונדריה כדורית.
10. השליכו את הסופרנאטנט ושמרו את הגלולה המיטוכונדריאלית על קרח.
11. שטפו את הגלולה המיטוכונדריאלית פעמיים באמצעות מאגר MS-EGTA קר כקרח. עבור כל שטיפה, יש להשהות מחדש את הגלולה המיטוכונדריאלית ב-5 מ"ל של מאגר MS-EGTA, לצנטריפוגר אותה בטמפרטורה של 10,000 x גרם ב-4°C למשך 10 דקות, ולהשליך את הסופר-נטנט.
12. לאחר השטיפה הסופית, השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את המיטוכונדריה ב-100 מיקרוליטר של מאגר MS-EGTA קר כקרח. שמור את המיטוכונדריה על קרח.
    הערה: יש להשתמש במיטוכונדריה לניסויים תוך שעה אחת.
13. מדדו את ריכוז החלבון במיטוכונדריה באמצעות בדיקת חלבון ברדפורד.

3. מדידה מבוססת קורא צלחות של ספיגת סידן מיטוכונדריאלי

הערה: כאן, הוא מתואר הפרוטוקול לניתוח ספיגת Ca²⁺ מיטוכונדריאלי באמצעות קורא לוחות רב-מצבי המצויד במזרקים. ניתן להשתמש בכל קורא לוחות עם יכולת לקרוא סידן ירוק-5N פלואורסצנטי (עירור/פליטה של 506/532 ננומטר) במצב קינטי עם מזרקי מגיב אוטומטיים כדי לשמור על התגובה מוגנת מפני אור.

1. תכנת את קורא הלוחות לבצע קריאה קינטית של סידן ירוק-5N פלואורסצנטי עם מדידות שנלקחות כל שנייה לזמן בדיקה כולל של 1,000 שניות. בנוסף, תכנת את מזרקי המגיב לחלק 5 μL של תמיסת CaCl₂ בנקודות הזמן של 30 שניות, 150 שניות, 300 שניות, 480 שניות ו-690 שניות.
   הערה: תזמון זריקות CaCl₂ מוגדר על ידי המשתמש, וניתן להתאים אותו בהתאם לצרכי הניסוי.
2. הקדימו את מזרקי המגיבים בתמיסת CaCl₂ לשימוש.
   הערה: הריכוז של תמיסת CaCl₂ מוגדר על-ידי המשתמש, וניתן לכוונן אותו בריצות הבאות כדי לבצע טיטרציה של כמות Ca²⁺ הנדרשת להפעלת פתיחת MPTP.
3. הוסיפו 200 מיקרוגרם מיטוכונדריה לבאר בודדת של צלחת בת 96 בארות.
4. הוסף את הנפח המתאים של חיץ KCl לבאר כך שהנפח הכולל של מיטוכונדריה ומאגר KCl יגיע ל -197 μL.
5. הוסף 1 μL של 1 M pyruvate ו 1 μL של 500 mM malate לתערובת המיטוכונדריה. יש לערבב בעדינות את המיטוכונדריה, ולדגור על המיטוכונדריה עם המצעים למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר למיטוכונדריה לקבל אנרגיה.
6. הוסף 1 μL של 1 mM סידן ירוק-5N מלא. מערבבים בעדינות על ידי pipetting.
   הערה: הגן על התגובה מפני אור לאחר הוספת צבע סידן ירוק-5N.
7. הפעל את הפרוטוקול הקינטי המתוכנת מראש ונטר פלואורסצנטיות של סידן ירוק-5N.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
קורא מיקרו-צלחות Synergy Neo2 Multimode עם מזרקים	ביוטק
הומוגנייזר רקמות	קימבל	886000-0022
צלחת 96 באר	קורנינג	3628
סידן ירוק-5N	Invitrogen	C3737
DMSO	Invitrogen	D12345
HEPES	סיגמא	H3375
EGTA	סיגמא	E8145
אשלגן כלורי	פישר	BP366-500
מגנזיום כלורי	סיגמא	M2670
נתרן פירובט	סיגמא	עמ' 2256
חומצה L-מאלית	סיגמא	M1125
סידן כלורי	סיגמא	C4901
אשלגן פוספט מונובייסיק	סיגמא	P0662