1. הכנת שלפוחיות חד-לאומיות גדולות (LUVs)
- הכינו LUV לשימוש בהם כמחקים את קרום התא לבדיקת דליפת פלואורסצנטיות.
- יש לערבב עם מזרק זכוכית המילטון פוספטידילכולין (DOPC, 786.11 גרם/מול), ספינגומיילין (SM, 760.22 גרם/מול) וכולסטרול (כול, 386.65 גרם/מול) ביחס מולארי 4:4:2. תמיסת השומנים מתקבלת מתמיסת מלאי של כל ליפיד המסיס במתנול/כלורופורם (3/1; נפח/נפח) בממס של 25 מ"ג/מ"ל בצלוחית זכוכית עגולה בנפח 25 מ"ל. בהתבסס על 4 μmol של DOPC, 4 μmol של SM ו- 2 μmol של Chol, תמיסת השומנים מתקבלת מתמיסת מלאי על ידי ערבוב של 126 μL, 117 μL ו- 31 μL, בהתאמה.
זהירות: מתנול הוא ממס רעיל ודליק וכלורופורם רעיל ומסרטן. יש לטפל בשניהם עם ההגנה המתאימה מתחת למכסה המנוע.
- יש לאדות מתנול/כלורופורם באמצעות מאייד סיבובי תחת ואקום במשך 45-60 דקות ב-60°C עד ליצירת שכבת שומנים מיובשת.
- הכינו שני פתרונות חיץ HEPES מלאי. הכינו את חיץ HEPES 1 על ידי ערבוב 20 mM HEPES (238.3 גרם/מול) ו-75 mM NaCl (58.44 גרם/מול) וכווננו את ה-pH ל-7.4. הכינו את חיץ HEPES 2 על ידי ערבוב של 20 mM HEPES ו-145 mM NaCl וכווננו את ה-pH ל-7.4. ניתן לאחסן מאגרי HEPES בטמפרטורה של 4°C למשך חודש.
הערה: מומלץ לבדוק את האוסמולריות של המאגרים באמצעות אוסמומטר.
- הכן תמיסת לחות שומנים על ידי המסת זוג מרווה צבע פלואורסצנטי בלתי חדיר, 8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, מלח דיסודיום ב 12.5 mM (ANTS, 427.33 גרם / mol) ו p-xylene-bispyridinium bromide ב 45 mM (DPX, 422.16 g/mol) בתמיסת חיץ HEPES. ערבוב ANTS עם DPX מוביל לפתרון בצבע צהוב. כדי להשיג ריכוזים של 12.5 מילימטר של ANTS ו 45 מילימטר של DPX, להמיס 21.4 מ"ג ו 76 מ"ג, בהתאמה ב 4 מ"ל של חיץ HEPES 1.
הערה: פתרון הידרציה שומנים ניתן לאחסן במשך 2 שבועות ב 4 ° C על ידי עטיפת הצינור עם רדיד אלומיניום.
- לבנות מחדש שלפוחיות מולטי-למלריות (MLV) על ידי השעיה מחדש של שכבת השומנים המיובשת עם 1 מ"ל של תמיסת הלחות השומנית ועל ידי ערבול עד להמסת שכבת השומנים המיובשת. ודא כי הפתרון הוא מסיס לחלוטין כמו אגרגטים שומנים קטנים ישפיעו לרעה על השלבים הקודמים. כמו כן, בדוק את הקיר של בקבוק זכוכית עגול תחתית כדי לוודא כי לא נשאר סרט שומנים.
הערה: התמיסה תיראה אטומה וצהובה בהירה לאחר המסיסות.
- יש להעביר את השלפוחיות לחמישה מחזורי הקפאה/הפשרה כדי לקבל שלפוחיות חד-למלריות. בצע כל מחזור על ידי הנחת בקבוק זכוכית עגול תחתית במשך 30 s בחנקן נוזלי לשלב הקפאה, ולאחר מכן להשאיר אותו באמבט מים במשך 2 דקות לשלב הפשרה.
הערה: טמפרטורת מי האמבטיה צריכה להיות גבוהה ב-5-10 מעלות צלזיוס מטמפרטורת ההתכה של השומנים.
- הכן מכבש שומנים על ידי הכנסת שני מסננים התומכים בלחות ראשונית עם חיץ HEPES בכל חתיכת מכבש פוליטטרה-פלואוראתילן (PTFE) המונחת במיכל מכבש המתכת.
- הניחו קרום פוליקרבונט לח HEPES (גודל נקבוביות 0.1 מיקרומטר, קוטר 25 מ"מ) על החלק העליון של תמיכת מסנן אחת.
- הרכיבו את שני מכלי מכבש המתכת והבריגו אותם.
- מניחים את המכבש המורכב במחזיק ומציגים מזרק 1 מ"ל בחור המתאים בקצה של כל חתיכת מכבש פוליטטרה-פלואוראתילן. שחול מתאים למעבר של הנוזל שנבדק ממזרק אחד לשני דרך קרום פוליקרבונט.
- בדוק את המכבש עם 1 מ"ל של חיץ HEPES טעון באחד מזרק 1 מ"ל כדי לוודא שאין דליפות או בעיות.
- החלף את מאגר HEPES של 1 מ"ל בדגימת MLV.
- בצע אקסטרוזיה על ידי העברת דגימת MLV ממזרק אחד לשני דרך קרום הפוליקרבונט לפחות 21 פעמים כדי לקבל LUV אחידים באותו גודל.
הערה: שחול צריך להתבצע בטמפרטורה גבוהה יותר מטמפרטורת ההתכה של תערובת השומנים.
2. טיהור LUV
- הכינו טיהור עמודות כדי להסיר עודפי ANTS ו-DPX שאינם עטופים.
- יש להציג ג'ל דקסטרן צולב (G-50) מרחף בתווך מימי עם 0.01% NaN3 (65 גרם/מול) בעמוד כרומטוגרפיה נוזלי (Luer Lock, ללא מעיל, 1.0 ס"מ x 20 ס"מ, נפח מיטה 16 מ"ל) עד 1 ס"מ מתחת לחלק העליון של החלק חסר הצבע של העמודה.
- פתח את הברז ותן לנוזל לזרום כדי ליישב את ג'ל דקסטרן צולב.
- שטף את העמודה על-ידי פליטה עם 20 מ"ל של חיץ HEPES 2 ומחק את זרימת הפלט של העמודה.
- סגור את הברז ברגע שהנפח המת של הממס מעל העמוד ממוזער (<100 μL) אך מספיק כדי למנוע התייבשות של ג'ל דקסטרן צולב.
- הניחו את ה-LUV הטריים (צהובים) על העמוד ותנו להם להיכנס לג'ל דקסטרן הצולב.
- הוסף ברציפות חיץ HEPES 2 לעמודה כדי לבצע את טיהור LUV.
- יש להוציא כ-2 מ"ל של חיץ HEPES 2 (אל תשכחו למלא באופן קבוע את החלק העליון של העמוד כדי למנוע ייבוש של ג'ל דקסטרן צולב): תמיסת ה-ANTS וה-DPX הצהובה החופשית נודדת לאט יותר מהליפוזומים.
- התחל לאסוף LUV מטוהרים בצינורות (1.5 מ"ל).
- שימו לב לטיפות של אלואנט מהעמוד וכאשר הן הופכות אטומות, הן מכילות ליפוזומים. שנה את הצינור כדי לשחזר את החלק המכיל LUV.
- יש להאזין עד שהטיפות כבר לא אטומות (~ 1 מ"ל). לאחר מכן, לפלוט עוד 0.5 מ"ל בשבר נפרד ולאחר מכן להפסיק eluting.
הערה: תקנים זמינים כעת במגוון רחב של משקלים מולקולריים, כערכות או משקלים מולקולריים בודדים לכיול נפח האלוציה של LUVs.
- עטפו את הצינורות עם LUV ברדיד אלומיניום כדי למנוע הלבנה של הצבע הפלואורסצנטי.
- לשטוף את העמוד עם 20 מ"ל HEPES חיץ 2.
- לאחר מכן ניתן לאחסן את LUV במשך שבוע ב 4 ° C.
הערה: מכיוון שיציבות LUV עשויה להיות תלויה בריכוז והרכב LUV, כמו גם בחוזק יוני, יש לשלוט בגודל ה- LUV באמצעות מכשיר פיזור אור דינמי (DLS) (ראה סעיף 4. אפיון גודל LUV והומוגניות) לפני כל בדיקה.
3. כימות ריכוז LUVs
- הערכת ריכוז LUV על ידי ערכת כימות פוספוליפידים, המאפשרת להעריך את ריכוז כולין. בדיקה זו עשויה להיות מיושמת כאשר פוספוליפידים עם כולין המכיל ראש קוטבי הוא משמעותי (>50% מה- LUVs).
- הכן את מגיב הצבע על ידי המסת 18 מ"ג של מצע כרומוגן ב 3 מ"ל של חיץ בתנאי.
- טען קוביית פוליסטירן, 10 x 10 x 45 מ"מ, עם 3 מ"ל של מגיב צבע.
- השתמש בריאגנט הצבע הטהור כתנאי ריק (ריק). הוסף 20 μL של דגימת LUV (בדיקה) או 20 μL של תמיסה סטנדרטית של ריכוז כולין ידוע (סטנדרטי).
- מערבבים היטב ודגרים במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37°C על כל התנאים (ריק, מבחן ורגיל).
- מדוד את הספיגה (צפיפות אופטית, OD) של דגימת הבדיקה והפתרון הסטנדרטי עם התמיסה הריקה כבקרה ב- 600 ננומטר עם ספקטרופוטומטר.
- בדוק את ערכי OD המאפשרים להעריך את ריכוז השומנים של LUVs, C[LUV], בשווה ערך לכולין בהשוואה לתקן הריכוז הידוע.
- בצע את החישוב באמצעות המשוואה הבאה:
C[LUV] (mol / l) = (OD Sample / OD Standard) x C [Standard] (mol / l)
הערה: ערכת כימות הפוספוליפידים סיפקה תמיסה סטנדרטית של כולין כלוריד (139.6 מ"ג/ליטר) ב-54 מ"ג/ד"ל המתאימה לריכוז המולרי של C[Standard] = 3.87 mmol / L. OD Sample ו-OD Standard הם הספיגות שנמדדו ב-600 ננומטר עבור תמיסות LUV וכולין, בהתאמה.
4. אפיון גודל LUV והומוגניות
- בצע מדידה באמצעות מכשיר DLS כדי לקבוע את גודל LUV (בננומטר) ואת אינדקס הפיזור (PdI).
- תכנת את "נוהל הפעולה הסטנדרטי" המתאים (SOP) על ידי ציון צמיגות הממס / החיץ והקובטה המשומשת
.
- מניחים 500 μL של תמיסת LUV בקובט פוליסטירן חצי מיקרו.
- הכנס את קוביית הפוליסטירן סמי-מיקרו במכשיר DLS.
- בטמפרטורת החדר, למדוד את התפלגות הגודל במונחים של גודל ממוצע (Z-ממוצע) של התפלגות החלקיקים ושל הומוגניות (אינדקס פיזור, PdI).
- כל התוצאות מתקבלות משתי מדידות בלתי תלויות שבוצעו כל אחת בשלושה מחזורים חוזרים.
הערה: הערכים הסטנדרטיים עבור LUV יהיו בגודל ממוצע של 137 ± 7 ננומטר עם PdI של 0.149 ± 0.041.
5. הכנת תמיסות פפטידים
- הכינו תמיסת מלאי של הפפטיד, אשר יש לנתח עבור בדיקת הדליפה.
- להמיס אבקת פפטיד (>95% טוהר) במים טהורים (למשל, 1 מ"ג פפטיד ב-500 מיקרוליטר מים טהורים).
הערה: מומלץ לדלל פפטידים במים טהורים ולהימנע ממסיסות דימתיל סולפוקסיד (DMSO), העלולה לגרום לממצאים (למשל, חדירת ממברנה).
- מערבולת את הפתרון הפפטידי במשך 5 שניות.
- סוניק את תמיסת הפפטיד באמבט סוניקציה במים למשך 5 דקות ולאחר מכן בצנטריפוגה למשך 5 דקות במהירות של 12,225 x גרם. אספו את הסופרנאטנט לקביעת ריכוז.
- למדוד את הספיגה ב-280 ננומטר של שלושה דילולי פפטידים בלתי תלויים ולאחר מכן לחשב את ריכוז הפפטיד באמצעות מקדם ההכחדה המולרי שלו ε (בהתאם לתכולת הטריפטופן וטירוזין ברצף הפפטידים) וכלל באר-למברט.
הערה: אם הפפטיד מכיל טריפטופן וטירוזין, מקדם ההכחדה המולרי ε מחושב על בסיס טריפטופן ε = 5,690 M-1 cm-1 וטירוזין ε = 1,280 M-1 cm-1. אם רצף הפפטיד אינו מכיל טריפטופן או טירוזין, ניתן לבצע בדיקות קולורימטריות אחרות כדי למדוד את הריכוז (למשל, BCA או ברדפורד).
- לדלל את תמיסת הפפטיד במים טהורים לתמיסה סופית של 100 מיקרומטר ולאחסן ב 4 ° C.
הערה: במים טהורים, לא מתרחשת התפרקות פפטידים במהלך אחסון של 4 מעלות צלזיוס. עם זאת, יש למדוד את ריכוז הפפטידים, כל שבועיים, כדי לוודא שלא מתרחש אידוי מים.
6. בדיקת דליפת פלואורסצנטיות
- בדיקת דליפת פלואורסצנטיות נמדדת על ספקטרופלואורומטר בטמפרטורת החדר. אורך גל עירור ופליטה קבועים ב- Ex = 360 ננומטר ± 3 ננומטר ו- Em = 530 ננומטר ± 5 ננומטר, בהתאמה.
- לדלל LUVs ב 1 מ"ל חיץ HEPES 2 לריכוז סופי של 100 מיקרומטר בקובט פלואורסצנטי קוורץ. הוסף מערבל מגנטי כדי להפוך את התמיסה להומוגנית במהלך הניסוי.
- מדוד את LUV לבד במהלך 100 השניות הראשונות, בין t = 0 s ו- t = 99 s על מנת לגשת לפלואורסצנטיות הרקע.
הערה: ניתן היה למדוד LUV בלבד במהלך כל הניסוי (15 דקות) על מנת לגשת לפלואורסצנטיות רקע ודליפות פוטנציאליות.
- לאחר מכן, מדדו דליפה כעלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות עם הוספת אליציטוטים של תמיסת פפטיד במשך 900 שניות הבאות (15 דקות). פרוטוקול זה מתבצע עבור כל ריכוז של פפטיד שנבדק בין 0.1 מיקרומטר ל -2.5 מיקרומטר.
- לבסוף, 100% פלואורסצנטיות הושגה על ידי מסיסים של LUV על ידי תוספת של 1 μL של Triton X-100 (0.1%, v/v), וכתוצאה מכך הגשושית לחלוטין בין t = 1,000 s ו- t = 1,100 שניות.
7. כימות הדליפה
- העלים ערכים המתקבלים לאחר t = 1,090 שניות כדי לשמור על אותו מספר נקודות עבור כל תנאי שנבדק.
- חשב את הפלואורסצנטיות המינימלית, Fmin, על ידי ביצוע הממוצע של 50 נקודות בין t = 0 s ו- t = 49 s (LUV בלבד).
- חשב את הפלואורסצנטיות המקסימלית, Fmax, על ידי יצירת ממוצע של 50 נקודות בין t = 1,041 שניות ו- t = 1,090 שניות (LUV עם Triton X-100).
- חשב את אחוז הדליפה (%דליפה) בכל נקודת זמן (t = x), לפי המשוואה הבאה:
%דליפה(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) x 100
- חשב את הממוצע ואת סטיית התקן עבור ערכים המתקבלים עם הכנת LUV שונים (n ≥ 2) עבור אותו מצב.
- התווה את אחוז הדליפה, %Leak(t=x), בפונקציה של זמן (s).
