1. איסוף ועיבוד צמחים
- איסוף ועיבוד דגימות צמחים
- לאחר איסוף דגימות צמחים, יש להקפיא דגימות במהירות הבזק על ידי טבילת חומר צמחי בחנקן נוזלי עם מלקחיים ולאחסן בטמפרטורה של -80°C. אם דגימות הצמחים שנאספו גדולות מכדי להקפיא אותן במהירות, קררו במהירות את הדגימות באמצעות קרח יבש והעבירו למקפיא בטמפרטורה של -80°C בהקדם האפשרי. תכולת אבות המזון העיקריים של חומר צמחי יכולה להשתנות לאחר הפרדת רקמות מהצמח, ולכן חשוב להקפיא דגימות צמחים בהקדם האפשרי לאחר האיסוף.
אזהרה: חנקן נוזלי עלול לגרום לכוויות קור חמורות כאשר הוא בא במגע עם העור. יש להקפיד להעביר חנקן נוזלי במיכלים מאושרים וללבוש ציוד הגנה אישי מתאים במהלך הטיפול בו, כולל כפפות הקפאה, משקפי ראייה, מגן פנים, סינר ומעיל מעבדה.
- ליופיליזציה של חומר צמחי באמצעות מייבש בהקפאה כדי להבטיח שהרקמות אינן פעילות מטבולית בזמן הוצאת המים. יבש עד שהמסה של הדגימה מתייצבת כדי להבטיח שכל המים הוסרו.
- לאחר ייבוש הדגימות, טחנו לאבקה דקה באמצעות מטחנה או טחינה. יש לאחסן דוגמאות בארון ייבוש עד לניתוח.
2. בדיקת חלבון מסיס
- הכנת דוגמאות
- שקלו דגימות משוכפלות של כל רקמה, כ-20 מ"ג כל אחת, לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות פוליסטירן בנפח 1.5 מ"ל ושפופרות תווית. דגימות אלה יכונו לאחר מכן דגימות לא ידועות. רשום את המסה המדויקת של כל דגימה, מכיוון שמידע זה יידרש כדי לחשב את החלבון המסיס % בכל דגימה לא ידועה. השתמש בצינורות מיקרוצנטריפוגות עם מכסי נעילה, מכיוון שמכסים שאינם ננעלים עלולים להיפתח במהלך שלב החימום הבא, וכתוצאה מכך לאבד את תמיסת הדגימה.
- להמיס ולבודד חלבוני דגימה לא ידועים
- באמצעות מיקרו-פיפטור מוסיפים 500 μL של 0.1 M NaOH לכל צינור. סוגרים היטב את המכסים ומסנקים למשך 30 דקות. מחממים אמבט מים חמים 90 °C.
זהירות: נתרן הידרוקסידי הוא בסיס חזק ועלול לגרום לכוויות במגע עם העור. למרות ש-0.1 M NaOH מייצג ריכוז נמוך, יש ללבוש כפפות מגן כדי למנוע גירוי בעור.
- הניחו צינורות במדף באמבט המים החמים למשך 15 דקות.
- צינורות צנטריפוגות ב 15,000 x גרם במשך 10 דקות. פיפטה את נוזל העל לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות מסומנים חדשים, באמצעות קצה פיפטה חדש עבור כל דגימה. הוסף 300 μL של 0.1 M NaOH לצינור המכיל את הגלולה והצנטריפוגה שוב ב 15,000 x גרם למשך 10 דקות. שוב, אספו את נוזל הסופרנאטנט ושלבו אותו עם נוזל הסופרנאטנט האחר מאותה דגימה. זוהי נקודת עצירה פוטנציאלית, וניתן לאחסן דגימות ב -4 מעלות צלזיוס למשך הלילה במידת הצורך.
- לזרז חלבונים צמחיים
- נטרל את ה- pH של תמיסת הסופרנאטנט על ידי הוספת 11 μL של 5.8 M HCl. אשר pH של ~7 על ידי טבילת נייר לקמוס בכל תמיסת דגימה.
אזהרה: חומצה הידרוכלורית היא חומצה מאכל חזקה שעלולה לגרום לכוויות במגע עם העור (מריחת עור או שאיפה). יש ללבוש כפפות למניעת גירוי בעור בזמן הטיפול בהידרוכלוריד.
- הוסיפו 90 מיקרוליטר של 100% חומצה טריכלורואצטית (TCA) לכל צינור ודגרו על צינורות על קרח למשך 30 דקות. משקעים של חלבונים יהפכו את התמיסה מ ברור אטום. אם זה לא קורה לאחר 30 דקות, מקררים את הצינורות למשך שעה אחת. זוהי נקודת עצירה פוטנציאלית, וניתן לאחסן דגימות ב -4 מעלות צלזיוס למשך הלילה במידת הצורך.
אזהרה: חומצה טריכלורואצטית היא מאכלת. יש ללבוש כפפות בעת הטיפול כדי למנוע מגע עם העור ולהימנע משאיפה.
- דגימות צנטריפוגות בטמפרטורה של 13,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4°C. יש להסיר בזהירות את הסופרנאטנט TCA על ידי שאיבתו באמצעות קו ואקום המחובר לקצה מיקרופיפט זכוכית דק (ניתן להשתמש באותו קצה בכל הדגימות). אין להפריע לכדורית החלבון על ידי הימנעות מיניקה כבדה ושמירה על מרחק מתאים בין קצה פיפטה לכדור.
- יש לשטוף את הגלולה במהירות עם 100 μL של -20°C אצטון. שלב זה מסיר את כל ה-TCA שנותר מהכדור, מה שעלול להפריע לבדיקת ברדפורד שלאחר מכן; עם זאת, אצטון יתחיל להמיס את גלולת החלבון אם יישאר במגע זמן רב מדי, ולכן יש להוסיף אצטון ואז לחלץ במהירות מהגלולה תוך 5 שניות.
- אפשרו לאצטון להתאדות על ידי הכנסת צינורות למכסה אדים או למקרר. לאחר מכן, ממיסים את גלולת החלבון על ידי הוספת 1 מ"ל של 0.1 M NaOH לכל צינור. המסה מלאה של הגלולה עשויה לדרוש מספר סבבי חימום באמבט מים חמים, מערבולות וסוניוקציה.
הערה: ככל שהצינורות יושבים זמן רב יותר במכסה האדים או במקרר וככל שהכדורים מתייבשים, כך יהיה קשה יותר להמיס אותם מחדש. מומלץ לייבש את הגלולה במשך 30 דקות, ולאחר מכן לבדוק נוכחות של אצטון כל 10-15 דקות עד שיהיה ברור כי האצטון התאדה (לא ניתן לזהות אדי אצטון).
- ערבבו תמיסות סטנדרטיות, דללו תמיסות דגימה לא ידועות וכמתו את תכולת החלבון הכוללת של דגימות לא ידועות באמצעות בדיקת ברדפורד.
- הכינו תמיסות סטנדרטיות של אימונוגלובולין G (IgG) לפי הריכוזים המפורטים בטבלה 1 (ניתן לערבב תמיסת מלאי ליופילית או IgG עם מים שעברו דה-יוניזציה כדי להשיג כל ריכוז). תקני האחסון בטמפרטורה של 4°C. בצלחת בעלת 96 בארות, הוסף 160 μL מכל תמיסת IgG סטנדרטית במשולש החל ממיקום A1 של צלחת הבאר (0 מיקרוגרם/μL במיקום A1, A2, A3, 0.0125 מיקרוגרם/μL במיקומים B1, B2, B3 וכו').
- הכינו תמיסת NaOH מדוללת על ידי הוספת 50 μL של 0.1 M NaOH ל-950 μL מים מזוקקים. כבקרה שלילית ריקה, הוסף 60 μL של תמיסה זו לצלחת הבאר במשולש (G1, G2, G3 מיקומים).
- הכינו דילולים של דגימות לא ידועות על ידי הוספת 50 מיקרוליטר מכל תמיסת דגימה ל-950 מיקרוליטר מים מזוקקים בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל. לאחר מכן, הוסף 60 μL של כל דגימה מדוללת לצלחת באר משולש, החל במיקום H1. לוח של 96 בארות אמור לאפשר ניתוח של 6 תקנים, 1 ריק ו-25 דגימות לא ידועות כאשר קוראים אותן בשלשה. כל צלחת באר מנותחת צריכה להכיל תקן IgG משלה ודוגמאות ריקות.
- הוסף 100 μL של מים מזוקקים לכל בארות הדגימות הריקות והלא ידועות. עכשיו כל באר צריכה להכיל סך של 160 μL. באמצעות פיפטה רב ערוצית (8 ערוצים), להוסיף 40 μL של צבע חלבון כחול מבריק G-250 Coomassie לכל באר בטור הראשון של צלחת הבאר. מערבבים את הצבע עם הדגימות על ידי צלילה מספר פעמים. חזור על הפעולה עבור כל העמודות האחרות, והחליף את קצות פיפטה כדי למנוע זיהום.
זהירות: Coomassie מבריק כחול G-250 הוא מגרה ויש להימנע ממגע עם העור, העיניים או הריאות. יש ללבוש כפפות כדי למנוע מגע עם העור. אם נוצר מגע עם העור, מוצר זה יכתים.
- השתמש במחט כדי לפוצץ את כל הבועות הקיימות בבארות, מכיוון שהן עלולות להפריע לקריאת ספקטרופוטומטר המיקרו-פלטות. נקו את המחט כדי למנוע זיהום בין בארות. תנו לצלחת המיקרו לדגור בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-פלטות, רשום את ערכי הספיגה עבור כל באר ב- 595 ננומטר.
טבלה 1. חישובי עקומה סטנדרטיים עבור בדיקת חלבון מסיס.כמות החלבון בכל תקן מחושבת על ידי לקיחת הריכוז של כל תקן והכפלתו בכמות התמיסה הסטנדרטית בכל באר (160 מיקרוליטר).
| ריכוז IgG (מק"ג/μL) | חלבון בדגימות סטנדרטיות (מיקרוגרם) |
| 0.0000 | 0 |
| 0.0125 | 2 |
| 0.0250 | 4 |
| 0.0375 | 6 |
| 0.0500 | 8 |
| 0.1000 | 16 |
