בדיקה קולורימטרית לכימות פחמימות לא מבניות ברקמות צמחים

תקציר

מקור: Deans, C. A. et al. כימות חלבון מסיס צמחי ותכולת פחמימות לעיכול, תוך שימוש בתירס (Zea mays) כדוגמה. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מתאר את השיטה לכימות הפחמימות הניתנות לעיכול הקיימות ברקמות צמחים. זה עוזר לאסוף נתונים מרקמות צמחים שונות כדי לחקור אקולוגיה תזונתית, אינטראקציות צמחים-אוכלי עשב ודינמיקה של מארג מזון.

פרוטוקול

1. איסוף ועיבוד צמחים

1. לאחר איסוף דגימות צמחים, יש להקפיא דגימות במהירות הבזק על ידי טבילת חומר צמחי בחנקן נוזלי עם מלקחיים ולאחסן בטמפרטורה של -80°C. אם דגימות הצמחים שנאספו גדולות מכדי להקפיא אותן במהירות, קררו במהירות את הדגימות באמצעות קרח יבש והעבירו למקפיא בטמפרטורה של -80°C בהקדם האפשרי. תכולת אבות המזון העיקריים של חומר צמחי יכולה להשתנות לאחר הפרדת רקמות מהצמח, ולכן חשוב להקפיא דגימות צמחים בהקדם האפשרי לאחר האיסוף.
   זהירות: חנקן נוזלי עלול לגרום לכוויות קור חמורות כאשר הוא בא במגע עם העור. יש להקפיד להעביר חנקן נוזלי במיכלים מאושרים וללבוש ציוד הגנה אישי מתאים במהלך הטיפול בו, כולל כפפות הקפאה, משקפי ראייה, מגן פנים, סינר ומעיל מעבדה.
2. ליופיליזציה של חומר צמחי באמצעות מייבש בהקפאה כדי להבטיח שהרקמות אינן פעילות מטבולית בזמן הוצאת המים. יבש עד שהמסה של הדגימה מתייצבת כדי להבטיח שכל המים הוסרו.
3. לאחר ייבוש הדגימות, טחנו לאבקה דקה באמצעות מטחנה או טחינה. יש לאחסן דוגמאות בארון ייבוש עד לניתוח.

2. בדיקת פחמימות לעיכול

1. הכנת דוגמאות
   1. שקלו דגימות משוכפלות של כל רקמה, כ-20 מ"ג כל אחת, לתוך צינורות זכוכית בנפח 15 מ"ל עם מכסי בורג מרופדים בגומי (אורך 100 מ"מ). דגימות אלה יכונו לאחר מכן דגימות לא ידועות. יש לסמן שפופרות עם טוש עמיד למים או עם סרט תיוג על העפעפיים ולרשום את המסה המדויקת של כל דגימה, מכיוון שמידע זה יידרש כדי לחשב את %הפחמימות בכל דגימה לא ידועה.
2. חלצו פחמימות לעיכול מכל דגימה לא ידועה.
   1. הוסף 1 מ"ל של 0.1 M H₂SO₄ לכל צינור והברג מכסים על צינורות בחוזקה. יש להכניס לאמבט מים רותחים למשך שעה.
      זהירות: חומצה גופרתית היא קורוזיבי מאוד. אנא לבשו כפפות, משקפי מגן וסינר בעת הטיפול ב-H₂SO₄, ובצעו שלב זה במכסה אדים.
   2. מצננים צינורות באמבט מים פושרים. שפכו את תכולת הצינור לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות מסומנים בנפח 1.5 מ"ל (אל תדאגו אם חומר צמחי כלשהו נשאר בצינורות הזכוכית).
   3. צינורות צנטריפוגות ב 15,000 x גרם במשך 10 דקות. הסר את נוזל supernatant עם מיקרו pipettor ומניחים לתוך צינורות microcentrifuge מסומן חדש 1.5 מ"ל. צינורות ניתן לשמור בקירור לילה בשלב זה. אם אתה ממשיך עם assay, עיין בשלב 2.3.2.
3. ערבבו פתרונות סטנדרטיים וכמתו את תכולת הפחמימות הניתנת לעיכול הכוללת של דגימות לא ידועות.
   1. הכינו תמיסות סטנדרטיות של גלוקוז D(+) עם הריכוזים המפורטים בטבלה 1. הכינו שש מבחנות זכוכית עם 400 מיקרוליטר מכל תמיסה סטנדרטית.
   2. פיפטה 15 μL של כל דגימה לא ידועה לתוך מבחנה משלה ולהוסיף 385 μL של מים מזוקקים לכל אחד עבור נפח כולל של 400 μL בכל מבחנה. במכסה אדים, הוסף 400 μL של 5% פנול לכל מבחנה דגימה סטנדרטית ולא ידועה, ולאחר מכן במהירות פיפטה 2 מ"ל של מרוכז H₂SO₄ לתוך כל מבחנה. אין לגעת בתוכן המבחנה עם קצה הפיפטה, רק להוסיף למשטח התמיסה (פיפטה מהדר עובד הכי טוב בשביל זה).
   3. תן צינורות לדגור במשך 10 דקות, ולאחר מכן בזהירות מערבלים את הצינורות כדי לערבב תוכן. יש לדגור למשך 30 דקות נוספות.
      זהירות: פנול וחומצה גופרתית הם חומרים מגרים קורוזיביים. כדי להגן מפני חשיפה לעור, עיניים ושאיפה, שלב זה צריך להתבצע במכסה אדים כימי באמצעות PPE מתאים, הכולל: מגן פנים או משקפי ראייה, כפפות גומי, סינר מעבדה ומגפיים. ערבוב פנול עם חומצה גופרתית גורם גם לתגובה אקסותרמית, אשר תגרום לצינורות להיות חמים.
   4. פיפטה 800 μL של דגימה מכל צינור לתוך כל אחד 3 פוליסטירן 1.5 מ"ל חצי מיקרו cuvettes (3 עותקים טכניים לכל דגימה). הגדר את הספקטרופוטומטר לקריאה של 490 ננומטר. יש לכייל לקובטה ריקה המכילה מים מזוקקים לפני קריאת תקנים או דגימות לא ידועות, ולסירוגין לאורך כל קריאות הדגימה. הפעל כל קובטה דרך ספקטרופוטומטר ורשום את הספיגה. ממוצע על פני עותקים טכניים משוכפלים עבור כל מדגם לא ידוע.
      הערה: במקרים מסוימים, הדגימות עשויות לעבור את סף הספיגה העליון. אם כן, יש לדלל את הדגימות בשלב 1.3.1. יש לקחת בחשבון גם דילולים בחישובים הבאים.
   5. חשב את הספיגה הממוצעת עבור כל תקן.
      הערה: כדי לחשב את כמות הפחמימות הניתנות לעיכול הכוללת הקיימת בכל דגימה לא ידועה באמצעות עקומת התקן, הכי קל לסגת מהספיגה הממוצעת של כל תקן כנגד המיקרוגרם של D(+)גלוקוז הקיים בכל תקן, אך ניתן גם לשרטט את ריכוז D(+)גלוקוז (מק"ג/μL) של כל תקן במידת הצורך. עם זאת, החישובים הבאים מתייחסים לעקומה סטנדרטית המבוססת על מיקרוגרמים, ולא על ריכוזים (מיקרוגרם/μL).
   6. חשב את העקומה הסטנדרטית על ידי התוויית הספיגה הממוצעת מול הכמות הכוללת של D(+)גלוקוז (מיקרוגרם) בכל תמיסה סטנדרטית. התאם קו רגרסיה ליניארית לנתונים אלה, ולאחר מכן השתמש במשוואה הבאה כדי לחשב את הכמות הכוללת של פחמימות (מיקרוגרם) בכל מדגם לא ידוע:
      M_c = (((A_x – b)/m)/(15))*1000
      M_c = מק"ג פחמימות במדגם
      _{A x} = ספיגה ממוצעת של דגימה לא ידועה
      b = y-intercept (קו רגרסיה סטנדרטי)
      m = שיפוע (קו רגרסיה סטנדרטי)
      מקדם המתאם של קו זה צריך להיות גדול מ -0.98 ובאופן שגרתי קרוב ל -0.99. לאחר מכן, השתמש במשוואה הבאה כדי לקבוע את אחוז הפחמימות בכל דגימה:
      P_c = ((M_c/1000)/(M_i))*100
      P_c = %פחמימות
      M_i = מסה התחלתית של מדגם (mg)

טבלה 1. חישוב עקומה סטנדרטית לבדיקת פחמימות לעיכול. כמות הגלוקוז בכל תקן מחושבת על ידי לקיחת הריכוז של כל תקן והכפלתו בכמות התמיסה הסטנדרטית בכל מבחנה (400 מיקרוליטר)

D(+)ריכוז גלוקוז (ug/uL)	D(+)גלוקוז בדגימות סטנדרטיות (ug)
0.0000	0
0.0375	15
0.0750	30
0.1125	45
0.1500	60
0.1875	75

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קורא Microplate (ספקטרופוטומטר)	מודל Bio-Rad	680 XR