כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. בדיקת גדילה טוקסופלסמה מבוססת לוציפראז
- זרעו פיברובלסטים של עורלה אנושית (HFFs) שבוע לפני חיסון הטפילים כדי להבטיח שתאי המאכסן יהיו בשליטה מלאה. בצע בדיקת דמה בצלחת שקופה כדי להבטיח שטפילים יישארו תוך-תאיים לאורך כל תקופת ההערכה.
הערה: כאן, הבדיקה מתבצעת 96-באר microplates. על פי הצרכים הניסיוניים, ניתן להגדיל אותו עד 384 או 1536 צלחות מיקרו .
- העבירו טפילי טוקסופלזמה ל-HFFs מתמזגים יומיים לפני השימוש על ידי העברת ~0.3-0.4 מ"ל של טפילים שעברו ליזה מלאה לתוך צלוחיות T25. לדגור על תאים מארחים נגועים ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך יומיים.
- מזרק 5 מ"ל של טפילים טריים דרך מחט בטיחות 21 G 5x כדי לשחרר טפילים תאיים, ולאחר מכן לעבור דרך מסנן 3 מיקרומטר כדי להסיר פסולת התא המארח. שטפו שאריות טפילים מהבקבוק באמצעות 7 מ"ל של מדיום D10 נטול פנול אדום, ואז עברו שוב דרך המסנן.
- טפילי צנטריפוגות ב 1000 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). יוצקים את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 10 מ"ל של פנול אדום ללא מדיה D10
.
- ספירת טפילים באמצעות hemocytometer כדי לקבוע את הריכוז.
- לדלל טפילים ל 1 x 104 טפילים / מ"ל עבור זן פראי (WT). עבור זני טפילים חסרי גדילה, להגדיל את הריכוז בהתאם כדי לראות עלייה משמעותית אותות luciferase.
- שאפו בזהירות מדיה מ-96 מיקרו-צלחות באר שנזרעו מראש עם HFFs וחסנו 150 מיקרוליטר של תרחיף טפילים לבארות בפורמט של שלוש עמודות וחמש שורות, המייצג שלושה שכפולים טכניים וחמש נקודות זמן.
- לדגור את microplate ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 4 שעות.
- שאפו בזהירות את המדיה מהבארות כדי להסיר טפילים שלא פלשו, ואז מלאו את הבארות במדיה נטולת אדום פנול RT בכל שורה (למעט השורה הראשונה).
- מערבבים נפחים שווים של PBS ו-2x מאגר בדיקת לוציפראז ומדללים את מצע הלוציפראז ל-12.5 מיקרומטר.
- הוסף 100 μL של מצע luciferase מדולל לתוך כל באר של השורה העליונה. דגרו על המיקרו-צלחות ב-RT למשך 10 דקות כדי לאפשר לתאים ליזה מלאה.
- מדוד את פעילות הלוציפראז באמצעות קורא microplate. הגדרות קורא הלוחות מפורטות בטבלה 1. כל קריאה מייצגת את המספר הראשוני של טפילים שפלשו 4 שעות לאחר ההדבקה.
- חזור על שלבים 1.9-1.12 עבור כל שורה כל 24 שעות במשך 4 ימים מבלי לשנות את המדיום. קריאות אלה משקפות את המספר הכולל של טפילים משוכפלים 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות ו -96 שעות לאחר ההדבקה.
- חשב את ממוצע הקריאות בכל נקודת זמן וחלק אותן בקריאות הממוצעות ב- 4 שעות כדי לקבוע את השינויים בקיפול בצמיחת הטפילים לאורך זמן.
- התווה את הנתונים באמצעות תוכנת גרפים.
- כדי לחשב את זמן ההכפלה, התווה את ערכי log2 של שינויי קיפול בנקודות זמן בודדות לאורך זמן הדגירה. השתמש בפונקציית רגרסיה ליניארית כדי לחשב את השיפוע, המייצג את זמן ההכפלה של כל זן.
טבלה 1: הגדרות קורא מיקרו-צלחות למדידת פעילות לוציפראז במהלך בדיקת צמיחת טוקסופלזמה מבוססת לוציפראז
| לוציפראז: | נקודת הקצה |
| זמן אינטגרציה: | 1 שניות |
| סט מסננים - פליטה: | אור מלא |
| אופטיקה: | סביבון |
| לקבל: | 135 |
| מהירות קריאה: | רגיל |
| לעכב: | 100 מטר/שניה |
| גובה קריאה: | 4.5 מ"מ |
