בדיקת Luciferase לחקר היעילות של כימיקלים אנטי-טפיליים נגד טפילים

תקציר

מקור: Key, M., et al. קביעת יעילות מעכבים כימיים כנגד צמיחת טוקסופלסמה גונדי תוך תאית באמצעות בדיקת גדילה מבוססת לוציפראז. J. Vis. Exp. (2020).

הסרטון מדגים את בדיקת לוציפראז המשמשת לקביעת יעילותו של מעכב כימי אנטי-טפילי נגד הפתוגן התוך-תאי Toxoplasma gondii. המחקר כולל טפילים המבטאים לוציפראז הפולשים לתאים המארחים כדי להשתכפל ולשרוד. המעכב הכימי נקשר עם פרוטאזות הציסטאין של הטפיל ומעכב את השכפול. פעילות הלוציפראז שזוהתה פרופורציונלית לשינויים בצמיחת הטפיל, וקובעת את יעילות התרופה נגד הטפיל.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הערכת יעילות עיכוב תרכובות כימיות נגד צמיחת טוקסופלסמה

NOTE: כאן מוצגת כדוגמה הערכה של עיכוב LHVS בצמיחת טוקסופלסמה. שמונה ריכוזים שונים של LHVS נבדקים, ושלושה שכפולים טכניים מבוצעים עבור כל אחד משלושת ההעתקים הביולוגיים עבור שני הזנים RHΔku80::NLuc ו- RHΔku80Δcpl::NLuc.

1. לפני ההדבקה בטפיל, זרעים HFFs למיקרו-צלחות של 96 בארות בפורמט של שלוש שורות ותשע עמודות עבור העתק ביולוגי אחד לכל תרכובת לכל זן. תאים מארחים יורשו לגדול לפחות 7 ימים לפני השימוש.
2. מעבר RHΔku80::NLuc ו- RHΔku80Δcpl::NLuc טפילים במשך יומיים לפני השימוש.
3. העבירו טפילי טוקסופלזמה ל-HFFs מתמזגים יומיים לפני השימוש על ידי העברת ~0.3-0.4 מ"ל של טפילים שעברו ליזה מלאה לתוך צלוחיות T25. לדגור על תאים מארחים נגועים ב 37 ° C עם 5% CO₂ במשך יומיים.
4. מזרק 5 מ"ל של טפילים טריים דרך מחט בטיחות 21 G 5x כדי לשחרר טפילים תאיים, ולאחר מכן לעבור דרך מסנן 3 מיקרומטר כדי להסיר פסולת התא המארח. שטפו שאריות טפילים מהבקבוק באמצעות 7 מ"ל של מדיום D10 נטול פנול אדום, ואז עברו שוב דרך המסנן.
5. טפילי צנטריפוגות ב 1000 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). יוצקים את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 10 מ"ל של פנול אדום ללא מדיה D10
.
6. ספירת טפילים באמצעות hemocytometer כדי לקבוע את הריכוז.
7. לדלל טפילים ל 1 x 10⁴ טפילים / מ"ל עבור זן פראי (WT). עבור זני טפילים חסרי גדילה, להגדיל את הריכוז בהתאם כדי לראות עלייה משמעותית אותות luciferase.
8. השהה טפילים במדיה נטולת פנול אדום ב 1 x 10⁴ טפילים / מ"ל.
9. יש לשאוב מדיה מצלחת המכילה HFFs קונפלוטיביים ולחסן כל באר ב-150 μL של תרחיף טפילים. לדגור את microplate ב 37 ° C ו 5% CO₂ במשך 4 שעות.
10. הכינו LHVS בשמונה ריכוזים שונים במאגר של 12 בארות על ידי דילול סדרתי. בדרך כלל, הריכוזים יורדים פי שלושה באופן דילול סדרתי.
    הערה: הריכוז הנמוך ביותר מופחת פי 6,561 ביחס לריכוז הגבוה ביותר. ניתן להתאים את שינוי הקיפול של הדילול בהתאם בהתבסס על תכונות שונות של תרכובות בודדות.
11. ב 4 שעות לאחר ההדבקה, לשאוף מדיה כדי להסיר טפילים שלא פלשו ולמלא כל באר מעמודות 2-9 עם 150 μL של מדיה בתוספת LHVS בריכוזים שונים. השאר את העמודה הראשונה מלאה בתווך רגיל כדי לשמש כבקרה שאינה מטופלת.
12. יש לדגור על המיקרו-צלחת בטמפרטורה של 37°C ו-5%_CO2 למשך 96 שעות נוספות.
13. שאפו בזהירות את המדיה מהבארות כדי להסיר טפילים שלא פלשו, ואז מלאו את הבארות במדיה נטולת אדום פנול RT בכל שורה (למעט השורה הראשונה).
14. מערבבים נפחים שווים של PBS ו-2x מאגר בדיקת לוציפראז ומדללים את מצע הלוציפראז ל-12.5 מיקרומטר.
15. הוסף 100 μL של מצע luciferase מדולל לתוך כל באר של השורה העליונה. דגרו על המיקרו-צלחות ב-RT למשך 10 דקות כדי לאפשר לתאים ליזה מלאה.
16. למדוד פעילות luciferase של בארות בודדות.
17. ממוצע פעילויות לוציפראז של שלושה העתקים טכניים מבארות של כל ריכוז LHVS בודד.
18. חלק את פעילות הלוציפראז הממוצעת עבור כל ריכוז LHVS בפעילות לוציפראז ממוצעת הנגזרת מטפילים לא מטופלים כדי לחשב את פעילות הלוציפראז המנורמלת באחוזים.
19. שרטט את פעילויות הלוציפראז המנורמלות כנגד ריכוזי LHVS בודדים באמצעות תוכנת גרפים (איור 1). עיכוב של pyrimethamine נגד צמיחת טפילים נמדד גם כבקרה. Pyrimethamine היא אנטיביוטיקה קלינית המשמשת לטיפול טוקסופלזמוזיס חריפה על ידי עיכוב מטבוליזם חומצה פולית בטוקסופלסמה.
20. חשב את ערכי IC₅₀ עבור תרכובות בודדות באמצעות השיטה המשובצת בתוכנת הגרפים, תגובה מנורמלת לעומת [מעכב], תחת תוכנית הרגרסיה "מנה-תגובה-עיכוב". IC₅₀ מחושב באמצעות הנוסחה הבאה:
    Y = 100/(1 + X/IC₅₀)
    כאשר: Y מייצג פעילויות לוציפראז מנורמלות של תאים נגועים תחת ריכוזים שונים של מעכב, ו- X מייצג ריכוזים בודדים של מעכב.

תוצאות

איור 1: הערכת יעילות עיכוב של LHVS ופירימתאמין באמצעות בדיקת גדילה מבוססת לוציפראז. טפילים חוסנו לתוך מיקרו-צלחת של 96 בארות במשך 4 שעות כדי לאפשר פלישה של תאים פונדקאים. טפילים שלא פלשו נשטפו, והצלחת הייתה מלאה במדיה שהכילה ריכוזים שונים של LHVS או פירימתאמין והודגרה במשך 96 שעות נוספות לפני קביעת פעילות הלוציפראז. קריאות הלוציפראז שנמדדו עבור טפילים שטופלו בריכוזי מעכבים בודדים נורמלו כנגד האות...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Biotek Synergy H1 היברידי Multi-Mode Microplate Reader	BioTek Instuments
Coelenterazine h	פרולום	301-10 hCTZ
תוכנה
תוכנת GraphPad Prism (גרסה 8)