בדיקת מיצוי Msp1 לחקר הסרת חלבוני TA לא מקומיים

תקציר

מקור: Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מדגים פרוטוקול במבחנה לחקר הסרה בתיווך Msp1 של חלבוני TA לא מקומיים המשולבים בדו-שכבה השומנית של הליפוזומים. חלבוני Msp1 ו-TA משולבים בליפוזומים, והטרנסלוקציה תלוית ה-ATP של חלבוני TA מאושרת באמצעות טיהור זיקה.

פרוטוקול

1. הכנת ליפוזום

1. שלבו מלאי כלורופורם של שומנים ביחסים מתאימים כדי לחקות את הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית.
   1. מכינים 25 מ"ג של תערובת שומנים. אנו משתמשים בתערובת מבוססת בעבר של שומנים המחקים קרומים מיטוכונדריאליים, המורכבת מיחס מולארי של 48:28:10:10:4 פוספטידילכולין (PC), פוספטידיל אתנולמין (PE) בביצת תרנגולת, פוספטידיל אינוסיטול מכבד בקר (PI), 1,2-דיולאואיל-sn-גליצרו-3-פוספו-L-סרין סינתטי (DOPS), וגליצרול סינתטי 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-גליצרול (TOCL). חישובים לדוגמה מוצגים בטבלה 1.
   2. הביאו את כל מלאי השומנים לטמפרטורת החדר לפני הפתיחה מכיוון שזה יגביל את העיבוי. מכיוון שלרוב המעבדות אין דרך מדויקת למדוד את ריכוז השומנים, כל מים שייספגו במלאי הכלורופורם ישנו את ריכוז מלאי השומנים ובכך את יחס השומנים המשמשים בבדיקה.
   3. מכיוון שמלאי השומנים מגיע באמפולות זכוכית, העבירו את כמות השומנים הנדרשת לבקבוקון זכוכית באמצעות מזרק 1 מ"ל. הוסף 2 מ"ג של dithiothreitol (DTT) לבקבוקון כדי למנוע חמצון השומנים. עבודה מהירה כמו אידוי של כלורופורם ישנה את ריכוז השומנים.
   4. מעבירים את שאריות השומנים לבקבוקון זכוכית נפרד ומתאימים לו מחיצה מסוג PFTE. הוסיפו 2 מ"ג DTT לבקבוקון, עטפו בפרפילם ואחסנו בטמפרטורה של -20°C כדי למנוע חמצון שומנים. נסו להשתמש בשומנים תוך 3 חודשים מרגע ההעברה לבקבוקונים. כדי למנוע זיהום פוטנציאלי של מלאי הכלורופורם על ידי נגר סמן, העבירו את המדבקות מהאמפולות המקוריות לבקבוקוני הזכוכית במקום לסמן בטוש.
2. התאדו כלורופורם תחת זרם עדין מאוד של חנקן תוך כדי סיבוב בקבוקון הזכוכית ברציפות ביד בתוך מכסה אדים, ולמעשה פעלו כרוטובאפ ידני. סובבו את הבקבוקון במהירות עקבית (20-40 סל"ד) ביד כדי לשמור על תנועת השומנים. המטרה היא לאדות את כל הכלורופורם ולקבל ציפוי אחיד של שומנים על כל בקבוקון הזכוכית.
   זהירות: כלורופורם הוא נוירוטוקסי, ושלב זה צריך להתבצע במכסה המנוע.
   1. חברו פיפטה טרייה של פסטר לצינור החנקן. אין לתת לאף אחד מהשומנים להתיז מהבקבוקון או על פיפטת פסטר. כוונו את הקצה לתחתית הבקבוקון כך שהאוויר יקפוץ מהתחתית וידחוף את השומנים כלפי מעלה לכיוון מרכז הבקבוקון. קבל ציפוי אחיד על כל הבקבוקון תוך הימנעות מכל הצטברות בפינות או ליד המכסה. כל התהליך הזה לוקח בערך 5 דקות.
   2. כאשר התערובת מסמיכה ל"חרוז" של שומנים, הנחו אותה למרכז הבקבוקון על ידי שינוי זווית הבקבוקון. ברגע שהחרוז מתחיל להיות קטן יותר, הגבירו מעט את זרם החנקן כדי לפזר את החרוז, וודאו שאף אחד מהשומנים לא נושף מהבקבוקון.
3. יש להסיר את שאריות הכלורופורם בוואקום.
   1. הניחו את בקבוקון הזכוכית על שואב אבק ביתי או משאבת ואקום דיאפרגמה למשך שעה אחת כדי להסיר את רוב שאריות הכלורופורם. שואבי אבק אלה בדרך כלל אינם חזקים מספיק כדי להסיר את כל הכלורופורם, אך הם יכולים לסבול כמויות קטנות של ממס טוב יותר מאשר שואבי אבק סיבוביים.
   2. שים בקבוקון על ואקום חזק (<1 mTorr) במשך 12-16 שעות כדי להסיר את כל שאריות כלורופורם. הקפידו להימנע מהקפצה של הבקבוקון במהלך תהליך זה.
4. להשהות מחדש את השומנים ב 1.25 מ"ל של חיץ ליפוזומים (50 mM HEPES KOH pH 7.5, 15% גליצרול, 1 mM DTT). כפי שהתחלנו עם 25 מ"ג של שומנים, התוצאה היא ריכוז של 20 מ"ג / מ"ל. יש להשהות מחדש את השומנים במלואם ללא גושים נראים לעין. אם השומנים הצטברו בפינת הבקבוקון, זה יכול להיות תהליך ארוך.
   1. מערבבים את הבקבוקון במרץ עד שהדגימה חלקה חלבית. אנו מוצאים שאם אידוי הכלורופורם נעשה כראוי בלילה הקודם, תהליך זה לוקח בערך 5-10 דקות.
   2. כדי להבטיח השעיה מלאה של השומנים, סובב על גלגל בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות ב~ 80 סל"ד. הוציאו את הבקבוקון מהגלגל פעם בשעה למשך דקה אחת של ערבוב כדי להבטיח ערבוב אחיד.
5. מעבירים שומנים בזהירות לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי של 1.5 מ"ל. בצעו 5 מחזורי הקפאה-הפשרה באמצעות חנקן נוזלי להקפאה ובלוק חום של 30°C להפשרה. שלב זה מסייע להמיר שלפוחיות multilamellar לבועיות unilamellar.
6. להבליט את השומנים.
   1. במהלך מחזורי ההקפאה-הפשרה, הכינו את המכבש הקטן. להרכיב את מיני extruder עם 10 מ"מ מסנן תומך קרום פוליקרבונט של גודל הנקבוביות הרצוי (אנו משתמשים 200 ננומטר). גודל המסנן ישפיע על גודל הליפוזום, מה שישפיע על ריכוז החלבונים הדרושים להרכבה מחדש (שלב 2.3).
   2. הניחו את המכבש הקטן על פלטה חמה והביאו את טמפרטורת המכבש ל-60°C.
   3. משכו את השומנים לתוך מזרק זכוכית אטום לגז 1 מ"ל והניחו בזהירות בקצה אחד של מכבש המיני. הניחו את המזרק הריק אטום לגזים בצדו השני של המכבש הקטן. אפשר לשומנים להתאזן לטמפרטורת מעמד המכבש למשך 5-10 דקות.
   4. מעבירים את השומנים למזרק החלופי על ידי דחיפה עדינה של הבוכנה של המזרק המלא. דוחפים את התמיסה מהמזרק החלופי למזרק המקורי. חזור על תהליך זה הלוך ושוב 15 פעמים, כך שבמעבר ה^-15 השומנים מסתיימים במזרק החלופי. נטר את עוצמת הקול בכל מעבר כדי לוודא שאין דליפות.
7. להכין aliquots חד פעמי של השומנים, להקפיא הבזק בחנקן נוזלי ולאחסן ב -80 ° C. הליפוזומים יציבים ב -80 ° C במשך מספר חודשים. החוקות מחדש דורשות 10 μL של ליפוזומים בכל פעם (שלב 2.3.4), ולכן נוח להכין 10 μL או 20 μL aliquots.

2. הרכבה מחדש של חלבון Msp1 ומודל TA

1. הכן את מאגר הרכבה מחדש: 50 mM HEPES pH 7.5, 200 mM אשלגן אצטט, 7 mM מגנזיום אצטט, 2 mM DTT, 10% סוכרוז, 0.01% נתרן azide, 0.2-0.8% Deoxy Big Chaps (DBC).
   1. מטב את תנאי הבנייה מחדש עבור אצווה חדשה של ליפוזומים. הריכוז של DBC וביו-חרוזים הדרושים לבנייה מחדש אופטימלית משתנה בהתאם לאצווה של ליפוזומים בשימוש. כדי להגביל את השונות בין הכנה להכנה, השתמש באותה כמות של DBC עבור כל הניסויים. בעת שינוי הרבה DBC, חזור על תהליך האופטימיזציה.
   2. הגדר סדרה של מבנים מחדש עם ריכוזים שונים של DBC (0.2% - 0.8%) וביו-חרוזים (25 מ"ג - 100 מ"ג) בכל פעם שמכינים אצווה חדשה של ליפוזומים. חשוב לא להוריד את DBC מתחת לריכוז מיצלה קריטי (CMC) של ~0.12%. לאחר אופטימיזציה של התנאים, אנו ממליצים לאסוף את כל הנתונים באמצעות אותם תנאי הכנה והרכבה מחדש של ליפוזומים.
   3. בדוק את האפקטיביות של תנאי ההרכבה מחדש השונים באמצעות בדיקת החילוץ המתוארת בשלב 3.
2. הכינו ביו-חרוזים בריכוז סופי של 250 מ"ג/מ"ל.
   1. שוקלים 2.7 גרם של ביו-חרוזים מיובשים ומרחפים מחדש בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל של 100% מתנול (כ-45 מ"ל) כדי להרטיב את החרוזים. בתחילה הרטיבו את החרוזים הביולוגיים במתנול כדי למנוע מאוויר להילכד בנקבוביות החרוזים. ברגע שיש מתנול, שמרו על הביו-חרוזים רטובים, שכן כל אוויר שנלכד על ידי הביו-חרוזים ישנה את יכולתם לספוג חומרי ניקוי.
   2. הסר מתנול על ידי שטיפת החרוזים 8x עם כ 45 מ"ל של מים טהורים במיוחד (18.2 mΩ), להלן המכונה ddH₂O. חרוזי גלולה על ידי סיבוב ב 3,200 x גרם במשך 1 דקה. דקנט את הנוזל והשהה מחדש ב- ddH₂O.
   3. לאחר השטיפה, יש להשהות מחדש ב-10 מ"ל של ddH₂O עם 0.02% נתרן אזיד ולאחסן ב-4°C. ניתן לאחסן Biobeads ב-4°C למשך מספר חודשים. מלאי זה הוא 250 מ"ג / מ"ל כפי שהוא מניח ~ 0.2 גרם הולך לאיבוד במהלך שלבי השטיפה.
3. חשב את גודל הליפוזום ואת מספר המולקולות הרצוי של חלבון TA ו- Msp1 לכל ליפוזום. זה יקבע את הריכוז של חלבון Msp1 וחלבון TA הדרוש להרכבה מחדש.
   1. ראשית, חשב את מספר מולקולות השומנים לכל ליפוזום חד-למלרי (N_סה"כ) באמצעות המשוואה
      
      כאשר d הוא קוטר הליפוזום, h הוא עובי הדו-שכבתי, ו-A הוא אזור קבוצת הראש השומנית.
      1. מדוד את קוטר הליפוזום לפי DLS. בדוגמה שלנו, התקבל ערך של 70 ננומטר לקוטר הליפוזום (d).
      2. השתמש בערך של 5 ננומטר עבור h ו- 0.71 ננומטר² עבור a, שהוא גודל קבוצת הראש עבור פוספטידילכולין. במצב הספציפי הזה, N_{בסך הכל} הוא 37,610.
   2. לאחר מכן, לחשב את הריכוז המולרי של שומנים M_שומנים באמצעות המשקל המולקולרי הממוצע של השומנים בתערובת. בדוגמה זו, ריכוז השומנים הוא 20 מ"ג/מ"ל (שלב 1.4) והמשקל המולקולרי הממוצע של שומנים הוא 810 גרם/מול (טבלה 1). התוצאה היא ערך של 0.0247 M עבור M_Lipid.
   3. לאחר מכן, חשב את הריכוז המולרי של ליפוזומים, M_Liposome, באמצעות המשוואה
      
      כאשר M_Lipid הוא הריכוז המולרי של שומנים משלב 2.3.2, ו- N_total הוא המספר הכולל של שומנים לליפוזום המחושב בשלב 2.3.1. בדוגמה זו, ריכוז מלאי הליפוזומים של 20 מ"ג/מ"ל הוא כ-660 ננומטר.
   4. חשב את כמות החלבון Msp1 ו- TA הנדרשת לתגובת הרכבה מחדש של 100 μL.
      הערה: הריכוז הסופי של שומנים במבנה מחדש הוא 2 מ"ג / מ"ל, שהוא דילול פי 10 של מלאי הליפוזום. זה נותן ריכוז ליפוזומי סופי של 66 ננומטר. הריכוז הסופי של Msp1 הוא 792 ננומטר, מה שנותן בממוצע 12 עותקים סה"כ (2 הקסמרים פונקציונליים) לכל ליפוזום. הריכוז הסופי של חלבון TA הוא 660 ננומטר, אשר נותן ממוצע של 10 עותקים לכל ליפוזום.
4. בצינור PCR, ערבבו יחד Msp1 מטוהר, חלבון TA וליפוזומים במאגר הרכבה מחדש. סדר החיבור הוא חיץ, חלבונים וליפוזומים אחרונים. הנפח הכולל הוא 100 μL. מניחים לתערובת לשבת על קרח למשך 10 דקות. לטהר את החלבון Msp1 ו-TA.
   1. השתמש בחלבון TA המאופיין היטב His-Flag-Sumo-Sec22 כמצע בקרה חיובי בעת הקמת הבדיקה לראשונה. מבנה זה כולל תג His-tag לטיהור קל, תג 3x-Flag לזיהוי על ידי כתם מערבי, תחום סומו למסיסות מוגברת, ואת TMD של חלבון ER-TA Sec22 להרכבה מחדש והכרה על ידי Msp1.
   2. ודא שתמיסות המלאי של חלבון Msp1 וחלבון TA הן בערך 100 מיקרומטר כדי למזער את ההשפעה של N-דודציל β-D-מלטוזיד (DDM) מטיהור החלבון על הבנייה מחדש. Msp1 מטוהר הוא ב 20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM נתרן כלורי, 0.1 mM Tris (2-carboxyethyl) פוספין הידרוכלוריד (TCEP), 0.05% DDM ואילו חלבון TA מטוהר הוא 50 mM Tris pH 7.4, 150 mM נתרן כלורי, 10 mM מגנזיום כלורי, 5 mM β-mercaptoethanol, 10% גליצרול, 0.1% DDM. תמיסות מלאי של כ-100 μM חלבון TA ומונומר Msp1 מבטיחות שרכיבים אלה יהוו <-5% מנפח ההרכבה מחדש הסופי, וכתוצאה מכך דילול של DDM מתחת ל-CMC.
5. הוסיפו את כמות הביו-חרוזים הרצויה לדגימה כדי להסיר חומר ניקוי.
   1. חתכו את קצה קצה פיפטה p200 לקוטר של^כ-1/8 אינץ' כדי שחרוזים יוכלו להיכנס דרך הקצה. מערבבים היטב את צינור הביו-חרוזים כדי לקבל תערובת אחידה ומסירים במהירות את המכסה והפיפטה בנפח לפני שהביו-חרוזים שוקעים. העבירו את החרוזים הביולוגיים לצינור PCR ריק.
   2. לאחר שההרכבה מחדש סיימה את הדגירה בת 10 הדקות שלה על קרח, השתמשו בקצה פיפטה לא חתוך כדי להסיר את כל הנוזלים מהחרוזים הביולוגיים. לאחר מכן להעביר את reconstitution 100 μL לתוך הצינור עם biobeads. זה חייב להיעשות במהירות, כך biobeads לא ללכוד אוויר, אשר יגרום חרוזים לצוף.
6. אפשר להרכבה מחדש להסתובב על גלגל ב~ 80 סל"ד למשך 16 שעות ב -4 מעלות צלזיוס.
7. הסר חומר משוחזר מביו-חרוזים. בצע סיבוב מהיר בפיקופוגה כדי לגלול את החרוזים הביולוגיים, ולאחר מכן השתמש בקצה צינור לא חתוך כדי להעביר את החומר המשוחזר לצינור PCR נקי. חזור על תהליך זה 1-2 פעמים עד שלא נותרו ביו-חרוזים בדגימה. שמור על הרכבה מחדש על קרח.
8. נקה מראש את החומר המשוחזר כדי להסיר חלבונים שלא הצליחו להתחבר מחדש לליפוזומים.
   1. הכן מאגר מיצוי: 50 mM HEPES pH 7.5, 200 mM אשלגן אצטט, 7 mM מגנזיום אצטט, 2 mM DTT, 100 ננומטר סידן כלורי.
   2. אזנו את עמודות הספין של הגלוטתיון עם מאגר מיצוי בהתאם להוראות היצרן. זה בדרך כלל כרוך 3 סבבים של כביסה עם 400 μL של חיץ ולאחר מכן צנטריפוגה ב 700 x גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את החיץ.
   3. הוסף 5 מיקרומטר מכל מלווה (GST-SGTA ו- GST-Calmodulin) לחומר המשוחזר. מלווים אלה ייקשרו ל-TMD של חלבונים שלא הצליחו להתחבר מחדש לליפוזומים. טיהור המלווים תואר קודם לכן.
      הערה: מלווים אלה זמינים מסחרית, אך אנו מעדיפים לטהר בתוך החברה כדי לשלוט בעלות ובאיכות. שני החלבונים נמצאים ב-20 מילימטר Tris pH 7.5, 100 mM נתרן כלורי ו-0.1 mM TCEP, ויש להם ריכוז מלאי סביב 160 מיקרומטר. SGTA מזהה מצעים עם TMD הידרופובי מאוד ואילו קלמודולין קושר TMD עם הידרופוביות בינונית. יחד, קוקטייל מלווה זה יכול לזהות מגוון רחב של מצעים.
   4. הוסף 100 μL של חיץ מיצוי לחומר המשוחזר, ומביא את הנפח עד 200 μL. הוסף זאת לעמודות הספין המאוזנות של גלוטתיון. שים לב שעמודות הספין של גלוטתיון מספקות את שחזור הדגימה הגבוה ביותר כאשר נפח הניקוי מראש הוא 200-400 μL.
   5. חבר את עמודות הסחרור וסובב ב~80 סל"ד ב- 4 ° C למשך 30 דקות כדי לאפשר למלווים להיקשר לשרף.
   6. סובבו את העמודים ב 700 x גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. הזרימה היא חומר מנוקה מראש שמתרוקן מחלבונים מצטברים. יש לשמור את החומר על קרח ולהמשיך ישירות עם בדיקת המיצוי.

3. בדיקת מיצוי

1. הכן צינורות לניתוח SDS PAGE. לכל תגובה יהיו 4 צינורות: INPUT (I), FLOW THROUGH (FT), WASH (W) ו-ELUTE (E).
   1. הוסף 45 μL של דגימת ddH₂O לצינור הקלט, 40 μL של ddH₂O לצינור FLOW THROUGH ו- 0 μL לצינורות WASH ו- ELUTE.
      הערה: יחס האות לרעש הטוב ביותר בבדיקה זו מתקבל כאשר דגימות המים, התברואה וההיגיינה וה-ELUTE מרוכזות פי 5 ביחס לדגימות הקלט והזרימה דרך. בשל הדילול במהלך הבדיקה, הדבר דורש לקיחת 5 מיקרוליטר דגימה עבור דגימת הקלט, 10 מיקרוליטר דגימה עבור דגימת FLOW THROUGH ו-50 מיקרוליטר דגימה עבור דגימות WASH ו-ELUTE.
   2. הוסף 16.6 μL של 4x SDS PAGE Loading Buffer לכל צינור. הנפח הכולל של כל דגימה הוא 50 μL לפני מאגר טעינת דפי SDS. הנפח הסופי הוא 66.6 μL (דגימה של 50 μL + 16.6 μL של 4x SDS PAGE Loading Buffer).
2. הרכיבו את בדיקת החילוץ.
   1. הכינו את תגובת המיצוי המכילה 60 μL של פרוטאוליפוזומים שסולקו מראש, 5 מיקרומטר של GST-SGTA, 5 מיקרומטר של GST-Calmodulin ו-2 mM ATP. שלב את כל הריאגנטים למעט ATP, המשמש ליזום את התגובה. להביא לנפח סופי של 200 μL עם Extraction Buffer.
      הערה: מכיוון ש-60 מיקרוליטר דגימה משמשים לכל בדיקת מיצוי, ניתן להשתמש בשחזור אחד לשלוש בדיקות מיצוי שונות. בצע בקרות חיוביות ושליליות (+ATP ו- -ATP) על חומר מאותה בנייה מחדש.
   2. בדיקת מיצוי טרום חם בבלוק חום של 30 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
3. התחל את בדיקת החילוץ על ידי הוספת ATP לריכוז הסופי של 2 mM וטיימר הפעלה.
   1. תן סיבוב של 5 שניות בפיקופוגה כדי לערבב ATP בתגובה. יש לדגור על התגובה ב-30°C למשך 30 דקות.
   2. במהלך הדגירה, לקחת 5 μL של התגובה ולהוסיף צינור קלט. העיתוי של זה גמיש.
   3. במהלך תקופת הדגירה הזו, יש לאזן עמודת ספין גלוטתיון אחת לכל דגימה בבדיקת המיצוי.
4. בצע משיכה כלפי מטה על מלווים כדי לבודד את החומר שחולץ.
   1. לאחר סיום הדגירה בת 30 הדקות, יש להוסיף 200 μl של חיץ מיצוי לצינור כדי להביא את הנפח הכולל ל-400 μL. יש להוסיף לשרף גלוטתיון שווה ערך ולאפשר לגלגל להיקשר ב-4°C למשך 30 דקות.
   2. סובבו את העמודים ב 700 x גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את הזרימה דרך. קח 10 μL עבור צינור FLOW THROUGH. דגימה זו מכילה מצעים אשר עדיין משולבים בשכבה הדו-שכבתית השומנית.
   3. לשטוף שרף פעמיים עם 400 μL של מאגר מיצוי, להשליך את הזרימה דרך. בשטיפה השלישית, לשמור על זרימה דרך ולקחת 50 μL עבור צינור WASH.
   4. הכינו 5 מ"ל של Elution Buffer על ידי הוספת גלוטתיון מופחת לריכוז סופי של 5 mM במאגר מיצוי. הכינו את המאגר הזה טרי בכל פעם.
   5. הוסף 200 μL של מאגר Elution לעמודת הסיבוב. דוגרים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. יש לסחוט במהירות של 700 x גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאמץ. שמור על הזרימה. חזור על התהליך פעם שנייה, כך נפח elution הכולל הוא 400 μL.
   6. קח 50 μL של דגימה מדגימת Elution והוסף אותה לצינור ELUTE.

השומנים	% שומה	מ"ו	ממוצע מ"ו	μmol ב 25 מ"ג	מ"ג ב 25 מ"ג	ציר כלור (מ"ג/מ"ל)	μL עבור 25 מ"ג
מחשב אישי	48%	770	369.6	14.82	11.41	25	456.4
PE	28%	746	208.88	8.64	6.45	25	258.0
פאי	10%	902	90.2	3.09	2.78	10	278.5
DOPS	10%	810	81	3.09	2.50	10	250.1
TOCL	4%	1502	60.08	1.23	1.85	25	74.2
Conc. Corr Avg MW				809.76
μmol ב 25 מ"ג				30.87

טבלה 1: חישובים לדוגמה להכנת ליפוזומים. המטרות העיקריות של טבלה זו הן לחשב את הריכוז, המשקל המולקולרי הממוצע המתוקן של תערובת השומנים ואת הנפח של כל ציר שומנים הדרוש לייצור הליפוזומים. MW וריכוז מלאי מגיעים מתוויות מוצרים. שומנים ושומה % נבחרים על ידי המשתמש.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ביו-חרוזים	ביו-ראד	1523920
פוספטידיל אינוסיטול בכבד בקר	אוונטי	840042ג	פאי
פוספטידיל כולין ביצת תרנגולת	אוונטי	840051ג	מחשב אישי
ביצת תרנגולת פוספטידיל אתנולמין	אוונטי	840021ג	PE
תמיכה במסנן	אוונטי	610014
בקבוקון זכוכית	VWR	60910L-1
עמוד ספין גלוטתיון	תרמו פישר	PI16103
מיני אקסטרודר	אוונטי	610020
סינתטי 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine	אוונטי	840035ג	DOPS
סינתטי 1', 3'-ביס[12-dioleoyl-snglycero-3-phospho]-גליצרול	אוונטי	710335ג	TOCL
מזרק 1 מ"ל	נורם-Ject 53548-001
מזרק 1 מ"ל אטום לגז	Avanti 610017