β-בדיקת גלקטוזידאז להערכת ציטוטוקסיות הנגרמת על ידי תרופות בטפילים

תקציר

מקור: Alonso, V. L. et al. In Vitro בדיקת תרופות כנגד כל שלבי מחזור החיים של טריפנוזומה קרוזי באמצעות טפילים המבטאים β-גלקטוזידאז. J. Vis. Exp. (2021)

בסרטון זה, אנו מתארים שיטה פשוטה וחזקה לקביעת הפוטנציאל ציטוטוקסי של תרופה טריפנוצידית נגד טפיל, טריפנוזומה קרוזי, המבטא את האנזים β-גלקטוזידאז. β-גלקטוזידאז משמש כאינדיקטור ליזה של התא, וניתן להשתמש בפעילותו כדי להעריך את השפעות התרופה.

פרוטוקול

1. בדיקת β-גלקטוזידאז

הערה: כימות פעילות β-גלקטוזידאז משמש כדרך עקיפה לקביעת מספר הטפילים. צפוי כי הצמיחה תעוכב בנוכחות תרכובת טריפנוצידלית, מה שיוביל למספר נמוך יותר של טפילים בהשוואה לביקורת הלא מטופלת, אשר יתבטא בפעילות β-גלקטוזידאז נמוכה יותר ולכן ספיגה נמוכה יותר.

1. לדגור על הטפילים עם BZN
   1. הוסף 100 μL של תמיסת 2x benznidazole (BZN) המתאימה לכל באר כדי להגיע לריכוז סופי של BZN של 80, 40, 20, 10, 5, ו 2.5 μM ל 100 μL של תרחיף epimastigote, תאי Vero עם amastigotes (2 ימים לאחר ההדבקה), או trypomastigotes בצלחת 96 באר.
   2. לדגור epimastigotes ב 28 ° C במשך 72 שעות, ואת trypomastigotes או תאי Vero נגועים עם amastigotes במשך 24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO₂.
      הערה: כל ריכוז תרופה צריך להיות מוערך לפחות משולש וכולל תרביות ביקורת של epimastigotes, trypomastigotes, ותאי Vero נגועים עם dimethylsulfoxide (DMSO).
2. תגובה קולורימטרית
   1. לאחר תקופת הדגירה של הטיפול, אם תאי Vero נגועים או טריפומסטיגוטים נמצאים בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) באדום פנול, החלף את המדיום ב- 100 μL של PBS 1x כדי למנוע הפרעה. בצע בארות ריקות משולשות המכילות רק 100 μL של תווך מתאים (או 1x PBS לפי הצורך).
      הערה: אין צורך להסיר את מדיום התרבות עבור epimastigotes במקרה של מדיום LIT או DMEM ללא אדום פנול. DMEM עם פנול אדום עדיין ניתן להשתמש; הכן באר ריקה עם DMEM בלבד כדי למדוד את ספיגת הבסיס ולאחר מכן החסר ערך זה במהלך ניתוח הנתונים. מדיום החרקים של שניידר, שהוא חסר צבע, הוא חלופה לאפימסטיגוטים.
   2. הוסף 40 μL של כלורופנול אדום β-D-galactopyranoside (CPRG) תמיסת מצע ו 10 μL של תמיסת דטרגנט לכל באר, קבלת ריכוז סופי של 200 μM CPRG ו 0.1% דטרגנט בנפח סופי של 250 μL בכל באר.
      הערה: ניתן להוסיף את תמיסת ההחייאה וחומר הניקוי יחד בנפח סופי של 50 מיקרוליטר לכל באר.
   3. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים ולמדוד את הספיגה ב-595 ננומטר בספקטרופוטומטר microplate.
      הערה: שינוי הצבע הצפוי הוא צהוב עד חום-אדמדם על המחשוף האנזימטי β-גלקטוזידאז (איור 1A). זמן הדגירה יכול להיות מוארך עד 4 שעות, ואת ספקטרום הספיגה של כלורופנול אדום ניתן לקרוא בין 570 ל 595 ננומטר עם התאמת עקומה דומה. דגירה של עד 24 שעות בנוכחות מצע CPRG הראתה אביזרי עקומה דומים.

תוצאות

איור 1: חישוב ערך IC50 של benznidazole עבור צורת epimastigote Dm28c. (A) צלחת בת 96 בארות עם אפימסטיגוטים המטופלים בריכוזי BZN שונים (2.5, 5, 10, 20, 40 ו-80 מיקרומטר) לפני הוספת החייאה (1), לאחר הוספה ראשונית של החייאה וחומר ניקוי (2), ולאחר דגירה עם החייאה וחומר ניקוי המראה את שינוי הצבע (3). (B) תרשים XY של הריכוזים הלוגריתמיים של BZN לעומת ספיגה (OD) ב-595 ננומטר...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחות 96 בארות	קורנינג	3599
Benznidazole	סיגמא אולדריץ'	419656
5 מ"ל פיפטה סרולוגית סטרילית	ג'ט ביופיל	GSP010005
10 מ"ל פיפטה סרולוגית סטרילית	ג'ט ביופיל	GSP211010
ארון בטיחות ביולוגית	טלסטאר	ביו II A/P
החייאה	רוש	10 884308001	כלורופנול אדום-β-D-גלקטופירנוסיד
DMEM, גלוקוז גבוה	Thermo Fisher Cientific	12100046	אבקה
DMSO	סינטורגן	SIN-061	דימתיל-סולפוקסיד
סרום עגל עובר	Internegocios SA	FCS FRA 500	סטרילי ומנוטרל חום
תאי Vero	ATCC	CRL-1587
ספקטרופוטומטר Microplate	ביוטק	סינרגיה HTX
צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל	טרסון	500010-N
G418 תמיסת מלח דיסולפט	רוש	G418-RO	ריכוז במלאי: 50 מ"ג/מ"ל