בדיקה מבוססת צלחת למדידת שחרור מונואמין מפרוסות מוח בחשיפה לתרופות בדיקה

תקציר

מקור: Pino, J. A. et al. בדיקה מבוססת צלחת למדידת שחרור מונואמין אנדוגני בפרוסות מוח חריפות. J. Vis. Exp. (2021)

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקה החוקרת מנגנוני שחרור מונואמין מתאי העצב של פרוסות מוח של חולדות ex vivo פעילות מטבולית, כאשר הן מטופלות בתרופות בדיקה. הבדיקה מדגימה כי תרופות נוירוסטימולנטיות גורמות לשחרור מונואמין באמצעות מובילי מונואמין תאי, בעוד שריכוז KCl גבוה גורם לשחרור מונואמין שלפוחית סינפטית בתיווך אקסוציטוזה.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. שחרור מונואמין אנדוגני Ex-vivo מפרוסות מוח או אגרופים

הערה: המכשיר המשמש לחלק זה מורכב מצלחת בת 48 בארות ומחזיק רקמות העשוי משש יחידות מסנן מיקרוצנטריפוגות ללא מסנני הכניסה המחוברים לקו קרבוגן (איור 1). כדי ליצור את המחזיק, השתמש במוט פלסטיק קשיח (למשל, ממגרד תאים) והדבק סופר את יחידות מסנן המיקרוצנטריפוגות ללא המסננים המוכנסים אליו. תן לו להתייבש במשך 1-2 ימים. הזמן הדרוש לניסוי שחרור מונואמין אנדוגני וריכוזים של אמפטמין, פלואוקסטין וקוקאין מבוססים על הספרות הנוכחית ופרוטוקולים קודמים.

1. הפעלת רקמות
   1. העבירו את רקמת המוח לכל באר של תא ה-efflux ואפשרו התאוששות למשך 30-50 דקות ב-37°C על מגלשה חמה יותר ב-0.5-1 מ"ל של חיץ אפלוקס מחומצן, עם בעבוע קבוע ועדין (איור 1B1).
   2. במהלך הדגירה מדללים את התרופות לריכוז הרצוי לניסוי. כל התרופות חייבות להיות מומסות במאגר אפלוקס, והריכוזים מבוססים על הספרות הנוכחית.
2. הדגירה הראשונה
   1. העבר את מחזיק הרקמה עם רקמת המוח לבארות המכילות 500 מיקרוליטר של חיץ אפלוקס מחומצן ודגור במשך 20 דקות ב 37 ° C. ודא כי חיץ מינימלי או ללא חיץ מועבר על ידי הקשה על המחזיק על קצה הבאר עד שאין חיץ עודף במחזיק.
   2. בניסויים עם חומרים פרמקולוגיים כגון מעכבי מוליכי מונואמין, דגרו על דגימות הרקמה עם התרופות המדוללות במאגר אפלוקס מחומצן (למשל, 10 מיקרומטר פלואוקסטין, 40 מיקרומטר קוקאין; ראו איור 1B2). הנפח הסופי בכל באר יהיה 500 μL.
3. דגירה שנייה
   1. העבר את המחזיק עם הרקמה לקבוצה חדשה של בארות המכילות מאגר אפלוקס כולל של 500 μL עם או בלי הריכוז הרצוי של כל תרופה. ודא שלא נשאר חיץ עודף. כל באר מייצגת n=1 עבור תנאי ניסוי. כל תנאי ניסוי מבוצע בשלשה.
   2. באר אחת כוללת חיץ אפלוקס מחומצן, הבאה 10-30 מיקרומטר אמפר , והבאר האחרונה כוללת 10-30 מיקרומטר אמפר בתוספת מעכבי טרנספורטר מונואמין. כל תרופה מומסת במאגר אפלוקס מחומצן.
   3. לדגור על הרקמה במשך 20 דקות ב 37 ° C עם 500 μL של מצב התרופה.
      הערה: בארות נוספות עשויות לכלול חיץ חום גבוה K+ מחומצן עם או בלי מעכבי טרנספורטר מונואמין. ממיסים כל תרופה במאגר ה-efflux המחומצן (500 μL).
   4. במהלך הדגירה השנייה של 20 דקות, לאסוף את התמיסה מן הבארות מן הדגירה הראשונה בשלב 1.2.1 ולהעביר צינורות microcentrifuge המכילים 50 μL של 1 N חומצה פרכלורית או חומצה זרחתית (תלוי בסוג HPLC, ריכוז סופי 0.1 N). הנפח הסופי של המדגם יהיה 550 μL. לשמור צינורות מיקרוצנטריפוגות על קרח ולתייג את צינורות #1.
   5. לאחר הדגירה השנייה של 20 דקות, להעביר את מחזיק הרקמה עם קטעי המוח או אגרופים לבאר ריקה ולשמור את הצלחת על קרח. מעבירים את הסופרנאטנט לצינורות מיקרוצנטריפוגות המכילות 50 μL של 1 N חומצה פרכלורית או חומצה זרחתית. הנפח הסופי של המדגם יהיה 550 μL. שמור צינורות מיקרוצנטריפוגות על קרח ותייג את הצינורות #2.
   6. הוסף 1 מ"ל של חיץ דיסקציה קר כקרח לכל באר המכילה רקמה. אוספים את כל הרקמה באמצעות פינצטה קטנה, ומעבירים לצינורות מיקרוצנטריפוגות נקיות.
   7. שמרו על צינורות עם רקמת מוח בטמפרטורה של -80°C. השליכו את 1 מ"ל של חיץ דיסקציה (איור 1B4).
   8. תמיסות סינון המתקבלות מכל דגירה באמצעות צינורות מסנן מיקרוצנטריפוגות (0.22 מיקרומטר) במהירות של 2,500 x גרם למשך 2 דקות. השתמשו בתסנין כדי לקבוע את תכולת המונואמין באמצעות HPLC עם זיהוי אלקטרוכימי (איור 1B5).

תוצאות

איור 1: מערך ניסויי לניסוי אפלוקס. (A) תא האפלוקס מורכב מלוח תרבית רקמה בעל 48 בארות וממגש מחזיק רקמות המחובר לקו הקרבוגן. (B) דיאגרמה המציגה את תכנון הניסוי לניסוי אפלוקס מונואמין אנדוגני שבו מוצגים הפעלת הרקמה (B1), טרום הדגירה עם/בלי מעכבי טרנספורטר מונואמין (B2), ניסוי האפלוקס (B3) ועיבוד הדגימה הסופי (B4-B5). (C...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת 48 בארות	נה	נה	בדיקת מעבדה
סידן כלורי נטול מים	סיגמא אולדריץ'	C1016	נוזל מוחי מלאכותי שונה או חיץ אפלוקס
D-(+)-גלוקוז	סיגמא	1002608421	מאגר דיסקציה
L-חומצה אסקורבית	סיגמא אולדריץ'	A5960	מאגר דיסקציה
מגנזיום סולפט	סיגמא	7487-88-9	KH Buffer
יחידות סינון מיקרוצנטריפוגות UltraFree	מיליפור	C7554	Assay - 6 כדי להתאים צלחת 48 באר
פרגלין קלורוהידראט	סיגמא אולדריץ'	P8013	נוזל מוחי מלאכותי שונה או חיץ אפלוקס
אשלגן כלורי	סיגמא	12636	KH Buffer
אשלגן פוספט מונובייסיק	סיגמא	1001655559	KH Buffer
סודיום ביקרבונט	סיגמא	S5761	מאגר דיסקציה
סודיום ביקרבונט	סיגמא אולדריץ'	S5761	מאגר דיסקציה
נתרן כלורי	סיגמא	S3014	KH Buffer