כל ההליכים המתוארים כאן בבעלי חיים אושרו על ידי בית הספר לרפואה אייקן בוועדת הליבה והשימוש המוסדית של הר סיני.
1. הכנה לפני בידוד תאי שסתום מעכברים בוגרים
- נקו ועיקרו את כל כלי הניתוח שמוצגים באיור 1A על-ידי שימוש באתנול 70% v/v ולאחר מכן אוטוקלאבינג שלהם למשך 30 דקות. נקו את סביבת העבודה הכירורגית עם 70% אתנול.
- הוסף 500 μL של פניצילין-סטרפטומיצין ל 50 מ"ל של HEPES 10 מ"מ. הכן aliquot של 50 מ"ל של 1x פוספט buffered מלוחים (PBS). שמור את הפתרונות על קרח.
- הכן 1 מ"ג / מ"ל ו 4.5 מ"ג / מ"ל פתרונות collagenase ולהשתמש 5 מ"ל של כל פתרון בצינורות 15 מ"ל כדי לבצע את ההליך כולו. להכנת 5 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל קולגנאז, יש לערבב 5 מ"ג של קולגנאז עם 2.5 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM, ללא סרום בקר עוברי (FBS) ו-2.5 מ"ל של HEPES של 10 מ"מ בתוספת אנטיביוטיקה (1% פניצילין-סטרפטומיצין משלב 1.2). סנן את התמיסות דרך מסנן 0.22 מיקרומטר כדי להסיר כל זיהום.
הערה: יש לשמור את התמיסות על קרח כדי להגן על האנזימים.
- יש לחמם את תמיסת ה-DMEM ל-37°C לפני השימוש בכל השלבים המתוארים להלן. הכן מדיום מלא על ידי תוספת DMEM עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1% נתרן פירובט, 5 מ"ל של 200 mM L-גלוטמין, 1 מ"ל של מגיב חיסול מיקופלסמה (ראה טבלה של חומרים), ו 10% FBS.
2. בידוד תאי שסתום
- כדי להשיג 105 תאים לניסוי, השתמש בחמישה עכברים בני 8 שבועות (מינימום שלושה). הניחו את העכבר בתא אינדוקציה יחד עם פיסת נייר טישו קטנה ספוגה ב -1 מ"ל של איזופלורן, אך אל תאפשרו מגע עם הרקמה. כדי לאשר כי החיה מורדמת לחלוטין; בדוק אם יש רפלקס צביטת בוהן, ולאחר מכן להרדים את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם. השתמש isoflurane כדי להקל על כל כאב לפני פריקת צוואר הרחם כמו ההליך המתואר להלן הוא סופני.
- הניחו את העכבר על משטח ניתוח, וקבעו את הכפות עם צינוריות כדי להחזיק אותו במקומו. לנקות את החזה ואת הבטן עם אתנול; לפתוח את הבטן ואת החזה עם מספריים. בעזרת מספריים כירורגיים קטנים, חותכים בין האטריום השמאלי לחדר השמאלי כדי להוציא את העכבר. לערבב את הלב עם 10 מ"ל של קר 1x PBS כדי להסיר דם מהלב.
- חתכו את הלב, והרחיקו 3 מ"מ מאבי העורקים העולה, כפי שמוצג באיור 1B. לנתח את שסתום אבי העורקים תחת סטריאומיקרוסקופ. חתכו את הלב אופקית באמצע החדרים (איור 1C). חתכו את החדר השמאלי לכיוון אבי העורקים, ונתחו בזהירות את המסתם האאורטלי (איור 1D-F). אגרו את השסתומים יחד בצלחת תרבית רקמה קטנה בקוטר 35 מ"מ.
- שטפו את השסתומים המבודדים בכלי תרבית תאים בקוטר 75 מ"מ עם 5 מ"ל של HEPES קר (10 מילימול) בתוספת אנטיביוטיקה (1% פניצילין-סטרפטומיצין) כדי להסיר דם (איור 2). הכינו שתי צינורות של 15 מ"ל של collagenase 1 מ"ג/מ"ל ו-4.5 מ"ג/מ"ל כמתואר לעיל בשלב 1.3.
הערה: לאחר הנתיחה, יש לתפעל את השסתומים המבודדים במכסה מנוע סטרילי לבטיחות ביולוגית כדי למזער את הזיהום.
- דגרו על השסתומים ב-collagenase type I (1 מ"ג/מ"ל) למשך 30 דקות ב-37°C עם טלטול מתמשך (איור 2). צנטריפוגה את הצינור במשך 5 דקות ב 150 × גרם, לשטוף את הגלולה פעם אחת עם 2 מ"ל של HEPES (10 mM), מערבולת במשך 30 s במהירות גבוהה. יוצקים את התוכן של צינור זה לתוך צלחת תרבית 35 מ"מ, בזהירות להעביר את שברי הרקמה באמצעות פינצטה דקה לתוך צינור חדש.
הערה: בשלב זה, ה- VICs עדיין אינם מנותקים מהרקמה, והגלולה מכילה חתיכות רקמה. כדי למנוע זיהום עם תאי אנדותל, אין לבצע צנטריפוגה לאחר מערבולות בשלב 2.5.
- לדגור על הגלולה בצינור של 15 מ"ל עם 5 מ"ל של collagenase מסוג I (4.5 מ"ג / מ"ל) ב 37 ° C תחת תסיסה מתמשכת במשך 35 דקות. להשעות מחדש את התאים עם פיפטה 1 מ"ל כדי להפריד את התאים, וצנטריפוגה ב 150 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את הגלולה ב-2 מ"ל של DMEM מלא. צנטריפוגה ב 150 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. חזור על שלב זה פעמיים כדי לנקות את התאים.
הערה: הגלולה עדיין תהיה כמה שברי רקמות.
- להשהות מחדש את הגלולה ב 1 מ"ל של מדיום שלם, ואת צלחת התאים בבאר אחת של צלחת תרבית תאים 6 בארות בכמות מינימלית של מדיום כדי להקל על חיבורם לצלחת התרבית. השאירו את התאים, ללא הפרעה, באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
- לאחר 3 ימים, בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא צמיחה טובה קרוב לפסולת הרקמה. ברגע ש-1,000 תאים נראים מתחת למיקרוסקופ, הסירו בזהירות את פסולת הרקמה בפינצטה אוטוקלאבית, ושנו את המדיום.
הערה: הצלחת לא צריכה להיות מופרעת; אם מספר התאים הנדרש אינו נצפה, מניחים את צלחת תרבית התאים בחזרה באינקובטור למשך יומיים נוספים.
- כאשר התאים הם 70% confluent (2.5 × 105), טריפסיניזציה ולאחר מכן להעביר אותם צלחת תרבית רקמה 75 מ"מ.
3. בדיקת הסתיידות חוץ גופית
- נקו את מכסה המנוע עם 70% אתנול, חממו את מדיום ה-DMEM ל-37°C.
- זרעו 100,000 תאים/מצב לתוך צלחות 6 בארות ב-DMEM מלא, ותרבית במשך 24 שעות ב-37°C.
- הכינו את מדיום ההסתיידות על ידי ערבוב 2 mM של NaH2PO4, 10-7 M אינסולין, ו 50 מיקרוגרם / מ"ל חומצה אסקורבית ב DMEM עם 5% FBS. עבור 93 מ"ל של DMEM, להוסיף 5 מ"ל של FBS, 1 מ"ל של אנטיביוטיקה (ריכוז סופי 1%), 1 מ"ל של פירובט נתרן (100 mM), 27.5 מ"ג של NaH2PO4, 5.8 μL של אינסולין, ו 5 מ"ג של חומצה אסקורבית.
הערה: סנן את התמיסה באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר לפני השימוש.
- לאחר 24 שעות, החלף את התווך הסופרנאטנטי בתווך ההסתיידות. לדגור את התאים במשך 7 ימים ב 37 מעלות צלזיוס. ביום השלישי יש להחליף במדיום הסתיידות טרי, ולהחזיר את הצלחת לאינקובטור להשלמת 7 ימי הטיפול.
- לאחר 7 ימים, להסיר את המדיום, ולשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של 1x PBS. לדגור על התאים ב 1 מ"ל של 0.6 N חומצה הידרוכלורית (HCl) במשך 24 שעות ב 37 ° C. לאסוף את HCl בצינור 1.5 מ"ל, ולאדות אותו במאייד סיבובי. להשעות מחדש את התוכן של כל הצינורות ב 60 μL של HCl.
הערה: הליך הייבוש חשוב כדי לרכז את התמיסה ושיהיה נפח זהה לכל מצב.
- השתמש בצלחת של 96 בארות כדי למדוד את ריכוז הסידן באמצעות מגיב Arsenazo III, הזמין בערכה מוכנה לשימוש (עיין בטבלת החומרים לפרטים נוספים).
- הכינו תמיסה סטנדרטית של סידן בריכוז של 10 מ"ג/ד"ל. שוקלים 10 מ"ג סידן הידרוקסידי (Ca(OH)2) וממיסים ב-100 מ"ל מים מזוקקים.
- בצלחת באר 96 ברורה, פיפט 2 μL של תמיסה ריקה (HCl, 0.6 N), התמיסה הסטנדרטית, הדגימה לכל באר (10 מ"ג / ד"ל), ואת הדגימות. בצע את הניסוי במשולש כדי לאמת את השתנות הפיפט. הוסף 200 μL של מגיב עבור כל מצב.
הערה: דגימות מעל 15 מ"ג / ד"ל צריך להיות מדולל 1: 1 עם מלוחים, לבדוק מחדש, ואת התוצאה מוכפל בשניים.
- לדגור על התגובה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: התגובה יציבה למשך 60 דקות.
- קרא ורשום את ספיגת הצלחת ב- 650 ננומטר. השתמש בנוסחה הבאה כדי לחשב את כמות הסידן בדגימות:
סידן (מ"ג/מ"ל) = (ספיגת דגימה/ספיגת תקן) × ריכוז התקן
