בדיקת Immunofluorescence לזיהוי נזק ל- DNA בתיווך PM2.5 בעוברי דגים

תקציר

מקור: Huang, Y., et al. שימוש באימונופלואורסנציה כדי לזהות נזק לדנ"א הנגרם על ידי PM_2.5 בלבבות עוברי דגי זברה. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מדגים בדיקה רגישה ביותר המבוססת על אימונופלואורסנציה לאיתור נזק חמצוני הנגרם על ידי PM_2.5 בליבם של עוברי דגי זברה על ידי מדידת רמות 8-OHdG ו- γH2AX, המצביעות על נזק לדנ"א ושברי DNA דו-גדיליים, בהתאמה.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. דגימת PM_2.5 ומיצוי תרכובות אורגניות

הערה: PM_2.5 נאסף באזור עירוני בסוג'ואו, סין, 1-7 באוגוסט 2015, כפי שתואר קודם לכן.

1. אופים מסנני קרום קוורץ בקוטר 47 מ"מ בכבשן עמום בטמפרטורה של 500 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי להסיר את הרכיבים האורגניים.
2. מקמו מסנן בדוגם PM_2.5 למשך 24 שעות של דגימה רציפה.
3. הסירו את הפילטר וייבשו במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר.
4. כמת את המסנן באמצעות איזון אנליטי.
5. חילוץ רכיבים אורגניים מהמסנן על ידי מיצוי Soxhlet באמצעות dichloromethane כממס.
6. יבש את EOM על ידי אידוי סיבובי באמבט מים של 60 מעלות צלזיוס וזרימת חנקן. יש להמיס EOM ב-DMSO ולאחסן בטמפרטורה של -20°C.

2. איסוף עוברים של דגי זברה וטיפול

בהם

1. שמרו על דגי הזברה בטמפרטורה של 28.5 ± 0.5 מעלות צלזיוס במערכת חקלאות ימית במחזור מחדש עם מחזור פוטופריודי של 14 שעות אור ו-10 שעות כהות.
2. הכניסו דגי זברה בוגרים בריאים למכל ביחס של 2:1 בין זכר לנקבה.
3. למחרת, אספו את העוברים ושטפו אותם במי מערכת (כלומר, מי רבייה של דגי זברה).
4. בחרו וחלקו באופן אקראי עוברים של דגי זברה המראים התפתחות תקינה (גודל אחיד, גרגרים מלאים וללא קרישת ביציות) ל-4 קבוצות בצלחות פטרי בודדות מזכוכית בקוטר של 7 ס"מ (כ-50 עוברים למנה).
5. יש לטפל בעוברים עם PM_2.5 (5 מ"ג/ליטר) בנוכחות או היעדר NAC במינון של 0.25 מיקרומטר מ-2 HPF עד 72 HPF. השתמש ב- DMSO כבקרת רכב לריכוז סופי של 0.1% (v/v).

3. תצפית מורפולוגית על עוברי דגי זברה ודיסקציה לבבית

1. ב 72 hpf, להעביר עוברים שקופיות זכוכית ולצפות תחת מיקרוסקופ סטריאו. תיעוד מומים בלב, כגון בצקת קרום הלב, שינוי בלולאה וגודל מופחת.
2. חישוב שיעורי המומים (אחוז העוברים עם מומי לב מתוך כלל העוברים החיים) וניתוח הבדלים בין קבוצות המשתמשות ב- ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן ההשוואה המרובה של טורקיה (p < 0.05 = מובהק סטטיסטית).
3. להרדים את העוברים עם 0.6 מ"ג / מ"ל MS-222 כדי לשתק אותם על שקופיות זכוכית.
4. הקלט פעימות לב במשך 30 שניות וכמת את הדופק באמצעות תוכנת ImageJ.
5. נתחו לבבות מעוברי דגי זברה בעזרת מחט מזרק חד פעמית תחת מיקרוסקופ סטריאו. אזהרה: הימנעו מלהרוס את צורת הלב.

4. בדיקת אימונופלואורסנציה

1. כדי להשתמש בבדיקת immunofluorescence כדי לזהות נזק לדנ"א המושרה על ידי PM_2.5 בלב עוברים של דגי זברה, השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לצייר עיגול בצד זכוכית נקייה.
2. הוסף 50 μL של 4% paraformaldehyde ל 1.25 מ"ל של פוספט Buffered מלוחים (PBS) כדי ליצור פתרון קיבוע.
3. הכניסו 3 לבבות חתוכים למעגל עט מחסום הידרופובי אחד ודגרו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
4. דקרו את התמיסה תחת המיקרוסקופ וייבשו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות לפחות, כך שהלבבות יתחברו לחלוטין למגלשות הזכוכית.
5. שטפו את המגלשות שלוש פעמים ב-PBS עם 0.1% Tween 20 (PBST) למשך 5 דקות לכל כביסה.
6. הוסף 50 μL של אלבומין בסרום בקר (BSA) ל- 1000 μL של PBST כדי לקבל תמיסת BSA של 5% ודגר על המגלשות בתא לח למשך שעה אחת כדי לחסום קשירת נוגדנים לא ספציפיים.
7. דקרו את התמיסה ושטפו את הדגימות שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות לכל כביסה.
8. יש לדלל 2 μL של נוגדן חד-שבטי עכברי כנגד 8-OHdG ו-2 μL של נוגדן רב-שבטי ארנב כנגד γH2AX ב-296 μL של PBST כדי לקבל תמיסת קוקטייל נוגדנים ראשונית עובדת.
9. יש לדגור על דגימות הלב עם 50 μL של תמיסת קוקטייל הנוגדנים הראשונית כנגד 8-OHdG ו-γH2AX בתא לח למשך שעה לפחות בטמפרטורת החדר או למשך הלילה ב-4°C (דגירה בלילה יכולה להגביר את עוצמת האות).
10. דקרו את התמיסה ושטפו את הדגימות שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות לכל כביסה.
11. לדלל 1 μL של נוגדן משני נגד עכבר עז שכותרתו FITC ו 1 μL של נוגדן משני cy3 עז נגד ארנב ב 498 μL של PBST כדי לקבל פתרון קוקטייל נוגדנים משני עובד ולדגור את הדגימות עם נוגדנים משניים (1:500 ב PBST) במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר בחושך.
12. דקרו את התמיסה ושטפו את הדגימות שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות לכל כביסה מוגנת מפני אור.
13. הוסף 20 μL של DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) לדגימות עבור צביעה גרעינית במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
14. יש למרוח כיסוי כדי להחליק ולאטום עם לק כדי למנוע התייבשות ותזוזה. לאחר מכן דמיינו את הדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי וכמתו את האות הפלואורסצנטי של אזור הלב באמצעות תוכנת ImageJ. חשב את השינויים היחסיים עם הממוצע של דגימות בקרת DMSO. קבע את המובהקות הסטטיסטית של הנתונים כמו בשלב 3.2.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נוגדן 8-OHdG	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה, ארה"ב	SC-66036	נוגדן ראשוני
איזון אנליטי	Sartorius,סין	BSA124S
BSA	Solarbio,בייג'ינג,סין	SW3015	לחסימה
דאפי	Abcam, ארצות הברית	ab104139	לכתם נגד גרעיני.
DMSO	Solarbio,בייג'ינג,סין	D8371
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	אולימפוס, יפן	IX73	להדמיית אותות פלואורסצנטיים
עז נגד ארנב IgG Cy3	Carlsbad,ארצות הברית	CW0159	נוגדן משני
עז נגד ארנב IgG FITC	Carlsbad,ארצות הברית	RS0003	נוגדן משני
N-אצטיל-L-ציסטאין(NAC)	Adamas-Beta, Shanghai, סין	616-91-1
שייקר אורביטלי	QILINBEIER,סין	TS-1
פרפורמאלדהיד	Sigma,סין	עמ' 6148	הפוך 4% paraformaldehyde עבור קיבוע.
פוספט חוצץ מלוחים	HyClone,ארצות הברית	SH30256.01	הכינו 0.1% טווין ב-PBS לכביסה.
דוגם PM2.5	TianHong,Wuhan, סין	TH-150C	לדגימת PM2.5 רצופה של 24 שעות.
מערכת חקלאות ימית במחזור מחדש	HaiSheng,Shanghai,סין		דג הזברה נשמר בו.
Soxhlet extractor	ZhengQiao,Shanghai, סין	BSXT-02	למיצוי רכיבים אורגניים.
סטריאומיקרוסקופ	Nikon,קנדה	SMZ645	לדיסקציה של הלב מעוברים של דגי זברה.
טריקאין מתאן-סולפונט (MS222)	Sigma,סין	E10521	להרדים עוברים של דגי זברה
טווין 20	Sigma,סין	עמ' 1379
נוגדן γH2AX	Abcam, ארצות הברית	ab26350	נוגדן ראשוני