$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת פרוסות קליפת המוח-היפוקמפוס
הערה: הכנת פרוסות קליפת המוח-היפוקמפוס משתמשת בחולדות P6-7 Sprague-Dawley.
- מערך תרבות והכנה בינונית
- ביום שלפני התרבות, להכין את המדיה הנדרשת ולמקם אותם ב 4 ° C.
- הכינו אמצעי דיסקציה: 25 מ"מ גלוקוז בתמיסת מלח מאוזנת של גיי (GBSS).
- הכנת תרבית בינונית: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% סרום סוסים (HS), 25 mM גלוקוז, 30 מיקרוגרם / מ"ל Gentamycin.
- הכנת אמצעי תחזוקה: נוירובזל-A (NBA), 2% B27, 1 מ"מ L-גלוטמין, 30 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין, HS (15%, 10%, 5% ו-0%).
- קצירת מוחות
- ממש לפני תחילת התרבית, להוסיף 1.1 מ"ל של מדיום תרבית לכל באר של צלחת 6 באר עם פיפטה P1000 ומניחים אותו ב 37 ° C.
- הניחו את כל הציוד (מיקרוסקופ דיסקציה, מסוק רקמות, מנורת נתיחה, כלי ניתוח, אלקטרודות, לוחות, תוספות וניירות סינון) בתוך ארון הבטיחות הביולוגי וחיקרו תחת אור UV למשך 15 דקות.
- התאימו את עובי הפרוסה ל-350 מיקרומטר.
- משכו את ה-GBSS מהמקרר. הוסיפו 5 מ"ל GBSS לשש צלחות פטרי. שש צלחות פטרי יידרשו לכל חיה.
- הרדימו את גור העכברושים. בצע עריפת ראש באמצעות מספריים חדים בבסיס גזע המוח של החיה.
- שטפו את ראש בעל החיים שלוש פעמים ב-GBSS קר והכניסו אותו לארון הבטיחות.
- בידוד רקמות והכנת פרוסות
- הכנס בחוזקה מלקחיים חדים לארובות העיניים כדי להחזיק את הראש.
- בעזרת מספריים דקים חותכים את העור/הקרקפת לאורך קו האמצע החל מפתח החוליות לכיוון האונות הקדמיות ומניחים אותו בצד.
- חותכים באותו אופן את הגולגולת ולאורך הסדק הרוחבי המוחי (רווח בין המוח למוח הקטן). בעזרת מלקחיים ארוכים ומעוקלים, הזיזו אותו זה מזה.
- השליכו את נורות הריח בעזרת מרית. הסירו את המוח מהראש ומקמו אותו ב-GBSS קר כקרח כשהמשטח הגבי פונה כלפי מעלה (איור 1A).
- הכניסו את המלקחיים העדינים לתוך המוח הקטן ולכו לאורך קו האמצע, כאשר המרית פותחת כל חצי כדור בזהירות רבה (איור 1B).
- בעזרת מלקחיים קצרים, הסירו בזהירות את הרקמה העודפת המכסה את ההיפוקמפי, מבלי לגעת במבנה ההיפוקמפוס. לאחר מכן בעזרת מרית, חתכו מתחת לכל היפוקמפוס (איור 1C).
- הרימו חצי כדור אחד והניחו אותו, כשההיפוקמפוס פונה כלפי מעלה, על נייר סינון. חזור על התהליך עם חצי הכדור השני ומקם אותו במקביל לראשון, בנייר הסינון. הניחו את נייר הסינון על מסוק הרקמות, כאשר ההמיספרות ניצבות ללהב, וחתכו את ההמיספרות לפרוסות של 350 מיקרומטר (איור 1D).
- הניחו את הרקמה החתוכה בתוך צלחת פטרי עם GBSS קר (איור 1E).
- הפרידו בזהירות את הפרוסות באמצעות אלקטרודות הקצה העגולות (איור 1F). שמור רק את הפרוסות עם קליפת המוח הרינלית וההיפוקמפוס שלמים מבחינה מבנית. אזורי DG ו-CA צריכים להיות מוגדרים באופן מושלם, כמו גם קליפת המוח האנטורינלית והפרירינלית (איור 1G).
- הניחו כל פרוסה על האינסרט (איור 1H-I), בעזרת מרית ואלקטרודה בעלת קצה עגול. הסירו את עודפי הדיסקציה סביב כל פרוסה בעזרת פיפטה P20 (איור 1J). ניתן לגדל בתרבית ארבע פרוסות קליפת המוח הרינלית וההיפוקמפוס בתרבית אחת (איור 1K).
- תחזוקת תרבות
- החליפו את המדיום אחת ליומיים.
- לחמם את המדיום ב 37 °C (77 °F).
- קח את הצלחות מהאינקובטור. הרימו כל תוספת על-ידי החזקת קצה הפלסטיק במלקחיים (איור 1L).
- השתמש ביד חופשית כדי לשאוף את המדיום מן הבאר. החזירו את האינסרט לבאר והוסיפו 1 מ"ל, עם פיפטה P1000, של תווך טרי ומחומם (איור 1M). חזור על הפעולה עבור כל התוספות. ודא שאין בועות אוויר כלואות בין הממברנה לבין המדיום.
הערה: פרוסות דמויות אפילפסיה עוברות חסך הדרגתי ומבוקר של סרום בתווך. החל מ-9 Days In Vitro (DIV) ואילך, פרוסות נשמרות ב-NBA ללא HS.
2. רישומים אלקטרופיזיולוגיים
הערה: רישומים אלקטרופיזיולוגיים בוצעו בפרוסות אורגנוטיפיות של קליפת המוח הרינלית-היפוקמפוס ב-7, 14 ו-21 DIV בתא מסוג ממשק. ההקלטות הושגו באמצעות מגבר, עברו דיגיטציה ונותחו באמצעות תוכנה. כל ההקלטות היו מסוננות באמצעות פסים (מסנן בסל בעל שמונה קטבים ב-60 הרץ ומסנן גאוס ב-600 הרץ).
- הכנת ההתקנה
- הכינו 50 מ"ל של מדיום NBA עם 1 מ"ל של B27 ו-250 מיקרוליטר של L-גלוטמין. להתחמם ב 37 °C (77 °F).
- הגדר את מערך האלקטרופיזיולוגיה במעגל סגור. בדוק אם קצב הזרימה הוא 2 מ"ל/דקה.
- פתח את שסתום הארגז (5% CO2/95% O2) ובדוק את מפלס המים במערכת.
- הניחו את נייר הסינון בתא ההקלטה של הממשק כדי לנקז את עודפי המדיום ואת נייר ניקוי העדשה מתחת למסגרת כדי לספק מדיום לפרוסה.
- הפעל את בקר הטמפרטורה, את המגברים ואת המיקרומניפולטור.
- תן לטמפרטורה בתא הממשק להתייצב על 37 מעלות צלזיוס לפני תחילת ההקלטות.
- הכינו נוזל מוחי מלאכותי (aCSF: 124 mM NaCl, 3mM KCl, 1.2 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 10 mM גלוקוז, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4 עם pH 7.4) והשתמשו בו כדי למלא את אלקטרודת הזכוכית במזרק. הניחו אותו באלקטרודה המקבלת.
- הקלטות של פעילות ספונטנית
- ברגע שהטמפרטורה יציבה, מוציאים את הצלחת מהאינקובטור וחותכים פרוסה אחת מהאינקובטור עם להב חד במיוחד. מניחים אותו בצלחת 60 מ"מ עם טיפה בינונית. קח אותו לתא ההקלטה של הממשק.
- מקם את הפרוסה בתא הממשק עם ההיפוקמפוס בפינה הימנית התחתונה. מקם את האלקטרודה המקבלת בשכבת התא הפירמידלי CA3.
- המשך לפרוטוקול הרכישה הרציף והקלט במשך 30 דקות.
