בדיקת צבירה PolyQ לזיהוי השפעה נוירופרוטקטיבית של תרכובת בתולעים

תקציר

מקור: Wang, Q. et al. Caenorhabditis elegans כמערכת מודל לגילוי תרכובות ביו-אקטיביות נגד רעילות עצבית בתיווך פוליגלוטמין. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מתאר שיטת in vivo לסינון הפוטנציאל המגן של תרכובות בדיקה נוירופרוטקטיביות בהפחתת צבירת polyQ בתאי שריר דופן הגוף של נמטודות ושיפור פרוטאוטוטוקסיות הקשורה לצבירה.

פרוטוקול

1. בדיקת צבירה PolyQ

1. הכנת נמטודות לבדיקת צבירת polyQ
   1. העבר 300-500 זחלי L1 מסונכרנים של AM141 לכל באר של צלחת 48 בארות עם 500 μL של מדיום S המכיל OP50 (OD₅₇₀ של 0.7-0.8) ו 5 מ"ג / מ"ל של אסטרגלן, בדרך כלל באר אחת לכל טיפול לנקודת זמן אחת.
   2. אטמו את הצלחת עם פרפילם ודגרו ב-20°C וב-120 סל"ד למשך 24, 48, 72 ו-96 שעות.
   3. קצרו את הנמטודות בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל ושטפו עם חיץ M9 >3 פעמים על ידי צנטריפוגה (1000 × גרם למשך דקה אחת) כדי להסיר את OP50 שנותר. השהה מחדש את הנמטודות AM141 במאגר M9, ושמור אותן מוכנות לרכישת תמונה.
2. רכישת תמונות פלורסנט וניתוח נתונים
   הערה: הנתונים מנותחים באופן אוטומטי באמצעות מערכת הדמיה זו בעלת תוכן גבוה. אם מכשיר הדמיה אוטומטי אינו זמין, ניתן להשתמש בשיטה קונבנציונלית להכנת פד אגרוז לרכישת תמונה כדי להשיג ביצועים דומים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי נפוץ.
   1. מעבירים 10-15 נמטודות לכל באר בצלחת של 384 בארות (נפח סופי 80 מיקרוליטר לבאר). הגדר 10 בארות משוכפלות לכל טיפול.
   2. הוסף 10 μL של 200 mM נתרן אזיד לכל באר כדי לשתק את הנמטודות ולאפשר להם לשקוע לתחתית (5-10 דקות).
   3. מקם את הלוח במערכת הדמיה בעלת תוכן גבוה כדי לקבל תמונות פלואורסצנטיות (עיין בטבלת החומרים לקבלת מידע על ההתקן והתוכנה).
   4. פתח את התוכנה לרכישת תמונות והגדר את הפרמטרים הבאים.
      1. פתח את החלון Plate Acquisition Setup וצור ערכת ניסויים ושם חדשים.
      2. בחר הגדלה כ- 2x, שילוב מצלמה כ- 1 וסוג צלחת כלוח 384 בארות.
      3. הגדר את הבארות והאתרים (אתר יחיד) שבהם יש לבקר.
      4. בחרו במסנן fluorescein isothiocyanate (FITC) והפעילו אפשרויות מיקוד מבוססות תמונה.
      5. הגדר את החשיפה כ- 300 ms.
         הערה: ניתן לבדוק ולהתאים את ההגדרות לעיל כדי לייעל את פרמטרי ההדמיה.
      6. שמור הגדרות רכישת תמונה ולחץ על כפתור רכישת צלחת כדי לרוץ.
   5. נתח את נתוני התמונה באמצעות תוכנת ניתוח התמונות.
      1. פתח את החלון Review Plate Data ובחר את צלחת הבדיקה לניתוח תמונה.
      2. לחץ פעמיים על בדיקה היטב כדי להציג את התמונה שלה.
      3. בחר את ספירת גרעינים כשיטת הניתוח ולחץ על הגדר הגדרות כפתור כדי להוציא חלון עבור ההגדרות הבאות.
      4. הגדר את תמונת המקור מערוץ FITC ובחר באלגוריתם הסטנדרטי.
      5. הגדר את פרמטרי ניתוח התמונה באופן הבא: רוחב מינימלי משוער = 10 מיקרומטר (= 2 פיקסלים); רוחב מרבי משוער = 50 מיקרומטר (= 12 פיקסלים); עוצמה מעל רקע מקומי = 1,000-2,000 רמות אפור.
      6. בדוק את ההגדרות הנוכחיות כדי למטב את שיטת הניתוח.
      7. שמור את ההגדרות והפעל את הניתוח בכל הבארות.
         הערה: לוקח ~ 20 דקות לסיים את הניתוח עבור צלחת אחת של 384 בארות.
      8. יצא את סך הגרעינים כמספר הכולל של Q40::YFP מצטבר בכל באר.
   6. ספרו את מספר הנמטודות בכל באר.
   7. חשב את המספר הממוצע של צברי Q40::YFP לכל נמטודה בכל קבוצה, והחל התאמת עקומה לא ליניארית לנתונים מכל נקודת זמן.
   8. חישוב מדד העיכוב:
      אינדקס עיכוב = (_{N control} - N_sample) / Ncontrol
      כאשר N_{control ו-N sample} הם המספר הממוצע של צברי Q40::YFP בקבוצת הבקרה ובקבוצת הטיפול, בהתאמה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
זן C. elegans
AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP]	המרכז לגנטיקה Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/AM141
זן E. coli
OP50	המרכז לגנטיקה Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
מגיב
נתרן אזיד	סינופארם כימית מגיב ושות', בע מ	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd
ציוד
צלחת תרבית תאים 384 בארות	Nest ביוטכנולוגיה ושות', בע ' מ	761001	https://www.cell-nest.com/page94? _l=en&product_id=85
צלחת תרבית תאים 48 בארות	Nest ביוטכנולוגיה ושות', בע ' מ	748001	https://www.cell-nest.com/page94? _l=en&product_id=85
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	גואנגג'ואו Micro-shot אופטי טכנולוגיה ושות', בע מ	Mshot MF31-LED	https://www.mshot.com/ article/442.html
מערכת הדמיה בעלת תוכן גבוה	התקנים מולקולריים	ImageXpress	https://www.moleculardevices.com/ מוצרים/מערכות הדמיה סלולרית#הדמיה עתירת תוכן
מיקרוצנטריפוגה	ג'יןקומפני	ג'נספיד X1	https://www.genecompany.com/ index.php/בית/מוצרים/ goodsdetails/gid/189.html
פארפילם מ	סיגמא-אולדריץ'	P7793-1EA	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
מצלמה דיגיטלית במיקרוסקופ	גואנגג'ואו Micro-shot אופטי טכנולוגיה ושות', בע מ	MS60	https://www.mshot.com/article/677.html
תוכנה
תוכנה לרכישה וניתוח תמונות	התקנים מולקולריים	מטא-אקספרס	מוצרי https://www.moleculardevices.com//מערכות הדמיה סלולרית/ תוכנה לרכישה וניתוח/ Metaxpress