מאמר שיטה

בדיקה לחקר ההשפעה של תרכובת בדיקה נגד רעילות עצבית בתיווך PolyQ בתולעים

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Wang, Q. et al., Caenorhabditis elegans כמערכת מודל לגילוי תרכובות ביו-אקטיביות נגד רעילות עצבית בתיווך פוליגלוטמין. J. Vis. Exp. (2021)

בסרטון זה, אנו מתארים שיטה להערכת ההשפעה הנוירו-פרוטקטיבית של תרכובת בדיקה, אסטרגלנית, על הישרדות עצבית ב- Caenorhabditis elegans מרעילות עצבית בתיווך polyQ. הבדיקה משתמשת ב- Caenorhabditis elegans המבטאים את החזרות polyQ המורחבות באופן חריג המאוחות ל- GFP בנוירוני ה- ASH שלהם כדי למדוד הישרדות עצבית לאחר טיפול בתרכובת בדיקה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בדיקת רעילות עצבית בתיווך PolyQ

  1. טיפול ב- C. elegans עם דגימות בדיקה
    1. כדי להכין נמטודות לבדיקת רעילות עצבית polyQ, העבר 300-500 זחלי L1 מסונכרנים של HA759 לכל באר של צלחת 48 בארות עם 500 μL של מדיום S המכיל OP50 (OD570 של 0.7-0.8) ו 5 מ"ג / מ"ל של אסטרגלן; בדרך כלל שלוש בארות משכפלות לכל טיפול.
    2. אוטמים את הצלחת עם parafilm ולדגור ב 15 ° C ו 120 סל"ד במשך 3 ימים.
    3. לאסוף את הנמטודות על ידי צנטריפוגה ולשטוף 3-5 פעמים עם חיץ M9. השהה מחדש את הנמטודות במאגר M9 לשימוש במבחני הישרדות והימנעות עצביים.
  2. הכנת כרית אגרוז
    1. מוסיפים 2 גרם אגרוז ל-100 מ"ל של חיץ M9 (2%, w/v) ומחממים את תמיסת האגרוז במיקרוגל לכמעט רתיחה.
    2. יש לפזר 0.5 מ"ל של אגרוז מומס על מרכז מגלשת זכוכית מיקרוסקופית בעובי 1 מ"מ המונחת בין שתי חתיכות של לוחות זכוכית בעובי 2 מ"מ. כסו בשקופית אחרת אנכית. ברגע שהאגרוז מתקרר ומתמצק, הסירו בעדינות את המגלשה העליונה.
  3. בדיקת הישרדות עצבית ASH
    1. הוסיפו טיפה של 20 מ"מ נתרן אזיד על כרית האגרוז. העבר 15-20 נמטודות HA759 לתוך הטיפה כדי לשתק אותם.
    2. הניחו מכסה בעדינות על הנמטודות. שמור את המגלשה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במצלמה דיגיטלית. בחר עדשה אובייקטיבית 40x ומסנן FITC כדי לזהות נוירוני ASH חיוביים ל- GFP באזור הראש של הנמטודות.
    3. בחר יותר מ -50 נמטודות בכל קבוצה באופן אקראי כדי לספור את מספר הנמטודות עם נוירוני ASH דו-צדדיים המסומנים בתווית GFP באזור הראש שלהם. חישוב שיעור ההישרדות של נוירוני ASH:
      הישרדות עצבית (%) = figure-protocol-1
      כאשר Nהישרדות ו-Nסה"כ הם מספר הנמטודות עם נוירוני ASH חיוביים ל-GFP והמספר הכולל של נמטודות שנבדקו בכל קבוצה, בהתאמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
זן C. elegans
HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)]המרכז לגנטיקה Caenorhabditis (CGC)https://cgc.umn.edu/strain/HA759
זן E. coli
OP50המרכז לגנטיקה Caenorhabditis (CGC)https://cgc.umn.edu/strain/OP50
מגיב
אגרוזביוווסט111860
נתרן אזידסינופארם כימית מגיב ושות', בע מ80115560https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af
551e96ff5f07cd
ציוד
צלחת תרבית תאים 48 בארותNest ביוטכנולוגיה ושות', בע ' מ748001https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
מיקרוסקופ פלואורסצנטיגואנגג'ואו Micro-shot אופטי טכנולוגיה ושות', בע מMshot MF31-LEDhttps://www.mshot.com/article/442.html
מערכת הדמיה בעלת תוכן גבוההתקנים מולקולרייםImageXpress Picohttps://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging
מיקרוצנטריפוגהג'יןקומפניג'נספיד X1https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html
מצלמה דיגיטלית במיקרוסקופגואנגג'ואו Micro-shot אופטי טכנולוגיה ושות', בע מMS60https://www.mshot.com/article/677.html
מיקרוגלחברת מידאה M1-211Ahttps://www.midea.cn/10000/10000000001
פארפילם מסיגמא-אולדריץ'P7793-1EAhttps://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
תוכנה
תוכנה לרכישה וניתוח תמונותהתקנים מולקולרייםמטא-אקספרסמוצרי https://www.moleculardevices.com//מערכות הדמיה סלולרית/ תוכנה לרכישה וניתוח/ Metaxpress

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Caenorhabditis elegansASHGFP

מאמרים קשורים