לבחון התנהגות כימו-הימנעותית בתולעים טרנסגניות באמצעות בדיקת הימנעות אוסמוטית

Abstract

מקור: Wang, Q. et al., Z. Caenorhabditis elegans כמערכת מודל לגילוי תרכובות ביו-אקטיביות נגד רעילות עצבית בתיווך פוליגלוטמין. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מתאר בדיקת הימנעות אוסמוטית לבחינת התנהגות כימו-הימנעותית במודל תולעת טרנסגנית. התנהגות הימנעות נבדקת בצלחת בנוכחות מחסום אוסמוטי גבוה ו chemoattractant. התולעים עם אובדן תפקודי של נוירונים נמשכות על ידי הכימואטרקנט, חוצות את המחסום האוסמוטי הגבוה והופכות משותקות באזור המלכודת בגלל תמיסת ההרדמה.

Protocol

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

הערה: ראה טבלה 1 לקבלת מתכוני הפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנת חומרים לבדיקת Caenorhabditis elegans

1. תחזוקת זני C. elegans
   1. השג זנים C. elegans (AM141 ו-HA759) ו-Escherichia coli (OP50 ו-NA22) (ראה טבלת חומרים).
   2. שמור על הנמטודות על צלחת המדיה לגידול נמטודות (NGM) שנזרעו עם E. coli OP50 ב 20 ° C עבור AM141 או 15 ° C עבור HA759.
2. הכנת תרבית חיידקי E. coli OP50
   1. בחרו מושבה אחת של E. coli OP50 מצלחת פסים Luria-Bertani (LB) וחסנו אותה ל-50 מ"ל של תרבית LB נוזלית.
   2. יש לדגור על חיידקי OP50 בשייקר בטמפרטורה של 37°C ו-200 סל"ד עד לצפיפות אופטית של ~0.5 ב-570 ננומטר (OD₅₇₀).
   3. אחסנו את תרבית החיידקים OP50 בטמפרטורה של 4°C והשתמשו בה תוך שבועיים.
3. הכנת צלחות NGM עם חיידקי OP50
   1. הוסף 20 גרם של אגר, 2.5 גרם של peptone, 3.0 גרם של NaCl, ו 975 מ"ל של מים deionized לבקבוק 1 L autoclavable. Autoclave ב 121 ° C למשך 30 דקות.
   2. הניחו את בקבוק האגר הנוזלי NGM על הספסל כדי להתקרר ל~ 60 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן הוסיפו את תמיסות הסטוק הסטריליות הבאות: 1 מ"ל של 1 M CaCl₂, 1 מ"ל של 1 M MgSO₄, 1 מ"ל של 5 מ"ג / מ"ל כולסטרול, ו 25 מ"ל של 1 M אשלגן פוספט (pH 6.0).
   3. יוצקים 20 מ"ל של גז טבעי נוזלי לצלחת פטרי סטרילית בקוטר 90 מ"מ, ומשאירים את הצלחות על הספסל להתקרר ולהתמצק. השאירו את הצלחות הפוכות והניחו להן להתייבש על הספסל בטמפרטורת החדר למשך יומיים.
   4. יש לפזר 200 מיקרוליטר של תרבית חיידקי OP50 על כל צלחת NGM ולפזר באופן שווה עם מוט ציפוי זכוכית סטרילי. סגרו את המכסים ודגרו על הצלחות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.
   5. אחסנו את צלחות ה-NGM עם OP50 בקופסת פלסטיק עם כיסוי בטמפרטורת החדר והשתמשו תוך שבועיים.
4. הכנת אוכלוסיית C. elegans מסונכרנת לגיל
   1. אספו נמטודות בוגרות גרבידיות לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל וצנטריפוגה ב 1000 × גרם למשך דקה אחת. שטפו שלוש פעמים והשעו מחדש את הנמטודות במאגר M9.
   2. מוסיפים נפח שווה של תמיסת אקונומיקה ומערבבים בעדינות במשך 3-5 דקות. מנטרים את ההלבנה כל 15 שניות תחת מיקרוסקופ נתיח.
      הערה: יש להכין את תמיסת האקונומיקה לפני השימוש על ידי ערבוב נפחים שווים של 10% NaOCl ו-1 M NaOH (טבלה 1).
   3. ברגע שרוב הנמטודות נשברות, עצרו את העיכול על ידי דילול עם חיץ M9. צנטריפוגה מהירה כדי להסיר את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה בחיץ M9 כדי לחזור על הכביסה שלוש פעמים.
   4. השהה מחדש את הגלולה בתווך S. תנו לשאריות הנמטודות להתיישב על ידי כוח הכבידה למשך 2-3 דקות בזמן שהביצים נשארות בסופרנטנט.
   5. שאפו את הסופרנאטנט לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי חדש. לאסוף את הביצים על ידי צנטריפוגה ב 1000 × גרם במשך 1 דקה.
   6. יש להשליך ~80% מהסופרנאטנט ולהעביר את הביצים לבקבוק סטרילי המכיל 20 מ"ל מדיום S. מניחים את הבקבוק בשייקר ודגורים על הביצים לילה ללא מזון במהירות 120 סל"ד לקבלת נמטודות L1 מסונכרנות.

2. מבחני רעילות עצבית בתיווך PolyQ

1. טיפול ב- C. elegans עם דגימות בדיקה
   1. כדי להכין נמטודות לבדיקת רעילות עצבית polyQ, העבירו 300-500 זחלי L1 מסונכרנים של HA759 לכל באר של צלחת 48 בארות עם 500 μL של מדיום S המכיל OP50 (OD570 של 0.7-0.8) ו-5 מ"ג/מ"ל אסטרגלן, בדרך כלל שלוש בארות משוכפלות לכל טיפול.
   2. אוטמים את הצלחת עם parafilm ולדגור ב 15 ° C ו 120 סל"ד במשך 3 ימים.
   3. לאסוף את הנמטודות על ידי צנטריפוגה ולשטוף 3-5 פעמים עם חיץ M9. השהה מחדש את הנמטודות במאגר M9 לשימוש במבחני הישרדות והימנעות עצביים.
2. בדיקת הימנעות אוסמוטית
   1. חלקו צלחת NGM נטולת מזון (9 ס"מ) לאזורים רגילים (N) ולמלכודת (T) בקו גליצרול של 8 M (~30 μL) באמצע. יש למרוח קו נתרן אזיד של 200 מילימטר (~20 μL) במרחק ~1 ס"מ מקו הגליצרול כדי לשתק את הנמטודות החוצות את מחסום הגליצרול לאזור T.
   2. העבר ~ 200 נמטודות כל אחת לאזור N של שלושה לוחות משוכפלים עבור כל קבוצה. הוסף טיפה של 1% בוטנדיון (~ 2 μL) לאזור T (1 ס"מ מקצה הצלחת) כדי למשוך את הנמטודות. מכסים מיד את מכסה צלחת הפטרי ודגרים בטמפרטורה של 23°C למשך 90 דקות.
   3. הניחו את מספר הנמטודות באזורי N ו-T תחת מיקרוסקופ. חשב את מדד ההימנעות באמצעות eq.
      מדד הימנעות = N / (T + N)
      כאשר N ו- T הם מספר הנמטודות באזורי N ו- T, בהתאמה. הנתונים מוצגים כאמצעים ± סטיית תקן (SD) של שלושה עותקים משוכפלים, המייצגים >3 ניסויים בלתי תלויים.
   4. בצע בדיקת t לא מזווגת, דו-זנבנית כדי להשוות את הנתונים מקבוצות האסטרגלה והביקורת.

טבלה 1:

תמיסה	הוראות הכנה	אחסון
1 M CaCl2	111 גרם CaCl2	אחסון בטמפרטורת החדר (RT)
	הוסף dH2O ל- 1 L
	אוטוקלאבה
1 M אשלגן פוספט (pH 6.0)	108.3 גרם KH2PO4	Store at RT
	35.6 אלף2HPO4
	הוסף dH2O ל- 1 L
	אוטוקלאבה
1 M MgSO4	246 גרם MgSO4·7H2O	Store at RT
	הוסף dH2O ל- 1 L
	אוטוקלאבה
כולסטרול באתנול (5 מ"ג/מ"ל)	0.5 גרם כולסטרול	לאחסן ב -20 °C
	מוסיפים אתנול ל-100 מ"ל
	אל תעשו אוטוקלאב!
1 M אשלגן ציטראט (pH 6.0)	הוסף 10.0 גרם חומצת לימון מונוהידראט	Store at RT
	להוסיף 146.75 גרם tri-potassium חומצת לימון monohydrate
	הוסף dH2O ל- 1 L
	אוטוקלאבה
תמיסת עקבות מתכות	0.93 גרם דיסודיום EDTA	אחסן בחושך ב- RT
	0.345 גרם FeSO4·7H2O
	0.1 גרם MnCl2·4H2O
	0.145 גרם ZnSO4·7H2O
	הוסף 0.0125 גרם CuSO4·5H2O
	הוסף dH2O ל- 500 מ"ל
	אוטוקלאבה
1 M NaOH	4 גרם NaOH	Store ב- RT
	הוסף dH2O ל- 100 מ"ל
פתרון אקונומיקה	0.5 מ"ל של 1 M NaOH	יש להכין טרי לפני השימוש
	0.5 מ"ל של 10% NaOCl
M9 מאגר	5 גרם NaCl	Store at RT
	3 גרם KH2PO4
	6 גרם Na2HPO4
	הוסף dH2O ל- 1 L
	אוטוקלאבה
	הוסף 1 מ"ל של 1 M MgSO4
S בזאלי	5.85 גרם NaCl	Store at RT
	6.0 גרם KH2PO4
	1.0 גרם K2HPO4
	הוסף dH2O ל- 973 מ"ל
	Autoclave, וקריר ל~ 60 ° C
	הוסף 1 מ"ל של 5 מ"ג / מ"ל כולסטרול אתנול
S בינוני	S בזאלי	Store at RT
	הוסף 3 מ"ל של 1 M CaCl2
	הוסף 3 מ"ל של 1 M MgSO4
	להוסיף 10 מ"ל של 1 M אשלגן ציטראט
	הוסף 10 מ"ל של תמיסת מתכות קורט
	כל הרכיבים עברו autoclaved, לא autoclave
5 mg/mL של אסטרגלאן	0.1 גרם אסטרגלי	לאחסן ב aliquots ב -80 °C
	הוסף 20 מ"ל של S בינוני
	סנן דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר
200 mM של נתרן אזיד	1.3 גרם NaN3	לאחסן ב 4 °C
	הוסף 100 מ"ל של S בינוני
8 M גליצרול	73.67 גרם גליצרול	Store ב- RT
	הוסף dH2O ל- 100 מ"ל
10% מניית בוטנדיון	מערבבים 10 μL של butanedione עם 90 μL של dH2O	חנות ב- RT
1% בוטנדיון	הוסף 10 μL של מלאי butanedione ל 90 μL של dH2O	חנות ב- RT
1 L של תרבות לוריא-ברטאני (LB)	10 גרם NaCl	Store at RT
	10 גרם טריפטון
	5 גר' תמצית שמרים
	הוסף dH2O ל- 1 L
	אוטוקלאבה

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
זני C. elegans
HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)]	המרכז לגנטיקה Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/HA759
זני E. coli
NA22	המרכז לגנטיקה Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/NA22
OP50	המרכז לגנטיקה Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
מגיב
אגר	שנגחאי EKEAR ביו-טכנולוגיה ושות', בע מ	EQ1001-500G	https://www.ekear.com
בוטנדיון	סינופארם כימית מגיב ושות', בע מ	80042427	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb 595ד0
כולסטרול	סיגמא-אולדריץ'	C8667	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product
גליצרול	אלאדין ושות', בע ' מ	G116203	https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html
פפטון	גואנגדונג HuanKai מיקרוביאלי מדע וטכנולוגיה ושות', בע"מ	050170ב	https://www.huankai.com/show/21074.html
נתרן אזיד	סינופארם כימית מגיב ושות', בע מ	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd
נתרן הידרוקסידי	סינופארם כימית מגיב ושות', בע מ	10019718	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 D3D8C68EC25E6
תמיסת נתרן היפוכלוריט	גואנגג'ואו כימית מגיב במפעל	7681-52-9	http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125
טריפטון	אוקסואיד בע"מ	LP0042B	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B
תמצית שמרים	אוקסואיד בע"מ	LP0021B	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B
ציוד
צלחת תרבית תאים 48 בארות	Nest ביוטכנולוגיה ושות', בע ' מ	748001	https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
צלחת פטרי 90 מ"מ	Sangon Biotech (שנגחאי) ושות', בע מ	F611003	https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003
אוטוקלאבה	פנסוניק	MLS-3781L-PC
מיקרוסקופ מנתח	ChongQing אופטי ושות', בע ' מ	ZSA0745	http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64
מיקרוצנטריפוגה	ג'יןקומפני	ג'נספיד X1	https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html
פארפילם מ	סיגמא-אולדריץ'	P7793-1EA	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
שאכר	ז'יצ'נג בע"מ	ZWY-2102C	http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html