בדיקת פצעים כדי להעריך את יכולת הנדידה של מיובלסטים מורינים בתרבות משותפת

תקציר

מקור: Toubat, O. et al., Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מתאר בדיקת ריפוי פצעים ללא מגע בתרבית משותפת כדי להעריך את יכולת הנדידה של מיובלסטים מורינים. זה עוזר להבין רכיבים של שליחת אותות וקבלת אותות של אינטראקציות איתות Wnt פרקריניות לא קנוניות במבחנה.

פרוטוקול

1. בדיקת פצע:

(איור 1 מתאר את המודל הסכמטי של הבדיקה)

1. אפשר לתוספות התאים O9-1 ולבארות תא C2C12 להיצמד ולהתרבות באינקובטור עד ששני התאים נמצאים במפגש ~ 70-80% לפני שתמשיך עם חלק זה של הפרוטוקול. אם התאים גדלים >90% במפגש, אל תמשיכו עם בדיקת השריטה, מכיוון שהתאים פשוט יתנתקו מהבאר.
2. חם 1x PBS ו C2C12 בינוני על ידי הצבתם באמבט מים 37 ° C.
3. הסר היטב את מדיום העל-נאטנטי מתא C2C12 ושטוף את התאים פעם אחת עם PBS 1x. הסר את PBS 1x ומיד לגרד את התאים עם קצה פיפטה P10 סטרילי.
   1. העבירו את קצה פיפטת P10 הסטרילי בחוזקה בכיוון אחד כדי להתפרש לכל אורכה או רוחבה של שכבת התא (למשל, מימין לשמאל, מלמעלה למטה). הקפד לגרד כל באר המכילה תאים רק פעם אחת.
      הערה: כדי למטב את תוצאות הגירוד, יש לגרד בארות של תנאי ניסוי שונים ברמה דומה של מפגש. כדי לעשות זאת, ודא כי כל באר 4 תאים יש תאים עבור כל תנאי ניסוי נדרש (למשל, טוב #1 שליטה שלילית, גם #2 שליטה חיובית). בנוסף, השתמשו בפיפטת P10 סטרילית חדשה לכל שריטה והפעילו כמות דומה של כוח על הפיפטה בכל פעם. אל תנסו ליצור יותר משריטה אחת בכל באר.
   2. לאחר גירוד, הוסף במהירות 1 מ"ל של PBS 1x בחזרה לבאר באמצעות קצה פיפטה P1000. חזור על תהליך זה עבור כל באר שתישרט.
      הערה: בהתחשב בשונות הקשורה לכל שריטה, מומלץ להשתמש במספר בארות (n = 3) ליצירת פצעים בכל תנאי ניסוי. עבוד במהירות מכיוון שקריטי למזער את משך הזמן שבו התאים נמצאים ללא PBS 1x במהלך שלבים אלה. לאחר הסרת 1x PBS מכל באר, אין לקחת יותר מ 5 שניות כדי ליצור פצע בכל באר.
4. לאחר יצירת פצע והוספת PBS 1x בחזרה לכל באר, צלם את השריטה באמצעות מיקרוסקופ הפוך בשדה בהיר והשתמש בתמונה זו כגודל הפצע הבסיסי (זמן 0). כדי לצלם תמונות, בצע את השלבים הבאים:
   1. הפעל את המחשב ואת המיקרוסקופ (ראה רשימת חומרים) על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה. הניחו את השקופית התאית על הבמה וסובבו את חוגת המטרה להגדלה של פי 5.
   2. פתח את תוכנת ההדמיה (ראה רשימת חומרים) על-ידי לחיצה כפולה על סמל התוכנה בשולחן העבודה של המחשב. לחץ על הכרטיסיה מצלמה במסך הבית של התוכנה. לחץ על Live button כדי להמחיש את התאים בכרטיסייה AxioCam IC.
   3. ודא שמסנן האור נמשך עד הסוף כדי לאפשר לאור לעבור למצלמה ולמסך המחשב. הזז ו/או סובב ידנית את שקופית התא כדי למקם את אזור הפצע במרכז התמונה החיה בכרטיסייה AxioCam IC.
   4. כדי לצלם תמונות, לחץ על הצמד כדי לפתוח כרטיסיה חדשה לצד הכרטיסיה מעגל-משולב (IC) של AxioCam המכילה את התמונה.
   5. כדי לשמור תמונת סטילס זו, לחץ על קובץ בפינה השמאלית העליונה של דף הבית של התוכנה | שמירה בשם | הזן את שם הקובץ בתיבה שם הקובץ. שמור את האיור בתבנית התמונה Carl Zeiss (*.czi) (הגדרת ברירת המחדל), ובחר שולחן עבודה בסרגל משמאל כדי לשמור את הקובץ בשולחן העבודה כקובץ .czi, שניתן לפתוח רק בתוכנת Zen lite 2012.
   6. כדי לשמור את התמונה כקובץ .tiff, לחץ על קובץ | שמירה בשם | הזן שם קובץ בתיבה שם הקובץ. שמור את האיור כקובץ תמונה מתויג (*.tiff) על ידי לחיצה על הלחצן שמור כסוג ובחירה *.tiff מהתפריט הנפתח.
      הערה: ניתן לפתוח את פורמט .tiff בכל תוכנת עיבוד תמונה.
   7. מקם מחדש באופן ידני את שקופית התא כדי לצלם 2-3 תמונות נוספות בנקודות אחרות של הפצע באותה באר.
      הערה: בסך הכל, התוצאה תהיה 3-4 תמונות לא חופפות בהגדלה גבוהה של הפצע בכל באר.
5. הסר את 1x PBS מכל באר והוסף 1 מ"ל של C2C12 medium.
   הערה: היזהר לא פיפטה אגרסיבי מדי בעת הסרת או הוספת פתרונות לתא היטב לאחר יצירת פצע, שכן זה עלול לגרום לתאים להתנתק מן החדר היטב. בנוסף, להטות את החדר היטב, כך שאיפה ו reintroduction של פתרונות יכול להיעשות בפינות של כל באר כדי למזער הפרעה monolayer התא.
6. הרכיבו את מערכת הקוקולטורה של הכנסת הבאר על ידי הצבה ידנית של התוספות המכילות את תאי O9-1 בכל באר של באר התא. דחפו בעדינות את התוספות כלפי מטה לתוך הבאר כך שתחתית התוספת יושבת בדיוק מעל תאי C2C12 שמתחתיה. החזרת מבני הכנסת הבאר לאינקובטור.
   הערה: אל תאפשר לחלק התחתון של העלון לגעת פיזית ולשבש באופן מכני את תאי C2C12 שמתחתיו.
7. אפשר לתאים לנדוד במשך 9-12 שעות בסך הכל. כדי לקבוע את זמן הנדידה האופטימלי, בדוק את התאים ב 6 שעות לאחר יצירת הפצע, ולאחר מכן כל 2-3 שעות לאחר מכן. סיים את הניסוי כאשר התאים בתנאי בקרה או בקרה חיובית מתחילים לכסות לחלוטין את הפצע.
   הערה: בהתחשב באופי אי-המגע של המבנה, אין צורך להסיר את התוספת העליונה מהבארות בעת בדיקת התקדמות נדידת המרווחים. שונות נודדת תיצפה בהתאם לגורמים כגון סוגי התאים המשמשים בניסוי זה, צפיפות התאים בזמן יצירת הפצע, רוחב הפצע שנוצר, ותנאי ניסוי של תאים מניפולטיביים (למשל, הפלת גנים, תוספת חלבון רקומביננטי). ריכוזים של ריאגנטים אלה צריכים להיקבע באופן ניסיוני עם הנחיות של המלצות היצרן.

תוצאות

איור 1: מודל סכמטי של הבדיקה.שלב 1 כולל הרחבה חוץ גופית של מיובלסטים C2C12 ו- NCCs באמצעות תאי מזין STO. שלב 2 כולל ציפוי של NCCs ותאי C2C12 במערכת coculture. שלב 3 כולל את בדיקת הפצע המבוצעת בתאי C2C12 הבסיסיים כדי להעריך את יכולת הנדידה התאית. שלב 4 כולל צביעה חיסונית עבור פאלואדין כדי להעריך ארכיטקטורה ציטולוגית ומורפולוגיה של תאים נודדים. קיצורים: NCCs = תאי פסגה עצבית; Ab = נוגדן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
C2C12 קו תאי מיובלסט מורין	ATCC	CRL-1772
מערכת שקופיות קאמרית, 4 בארות	תרמופישר סיינטיפיק	154526
מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM), גלוקוז גבוה (4.5 גרם/ליטר), לגלוטמין (2 מילימול)	קורנינג	10-017-CV	מאוחסן ב-4°C
קצוות פיפטה מדורגים וסטריליים, 10 μL	ארה"ב סיינטיפיק	1111-3810
קו תאי הפסגה העצבית O9-1	מיליפור סיגמא	SCC049
מלח חוצץ פוספט (PBS), 1x, ללא סידן ומגנזיום, pH 7.4	קורנינג	21-040-CV	מאוחסן ב-4°C
תמיכה חדירה בז לצלחת 24 בארות עם קרום PET שקוף 0.4 מיקרומטר	קורנינג	353095
סרום בקר עוברי	פישר סיינטיפיק	W3381E	מאוחסן ב 50 מ"ל aliquots ב -20 °C
מיקרוסקופ האור ההפוך Axio Vert.A1	Carl Zeiss AG
תוכנת זן לייט 2012 מיקרוסקופיה	Carl Zeiss AG		תוכנת הדמיה