בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים לאימות מצומדים כימית של נוגדן-אנטיגן מצומדים כימית

תקציר

מקור: Volckmar, J. et al., צימוד כימי של נוגדן מטוהר מכוון DEC-205 עם חלבון באורך מלא למיקוד תאים דנדריטיים בעכבר במבחנה וב- Vivo. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים את הזיהוי של קומפלקסים מצומדים כימית של נוגדנים-אנטיגן באמצעות טכניקת הבדיקה החיסונית המקושרת לאנזים סנדוויץ', או ELISA. הנוגדן שנלכד נקשר לאפיטופ הספציפי של האנטיגן של הצמידות נוגדן-אנטיגן, אשר ניתן לדמיין מאוחר יותר באמצעות נוגדן משני מקושר אנזים.

פרוטוקול

1. ייצור αDEC-205 מקו תאי ההיברידימה NLDC-145

1. לייצור נוגדנים, הפשירו תאי NLDC-145 בהקפאה המייצרים αDEC-205 ב-37°C באמבט מים. הרחב את התאים ב 37 ° C ו 5% CO₂. שני בקבוקים בגודל 75 ס"מ^יידרשו כדי להמשיך בייצור נוגדנים. יש לבצע נהלי תרביות תאים בארון בטיחות כדי להבטיח תנאי עבודה בטוחים ולמנוע זיהום של התרביות.
   1. יש להשהות 1 מ"ל של תאים מופשרים (1 x 10,⁶ - 5 x 10,⁶ תאים/מ"ל) ב-9 מ"ל של מדיום ISF-1 בתוספת 1% פניצילין/סטרפטומיצין (שחומם מראש ל-37°C) לתוך בקבוק תרבית תאים (25 ס"מ²). מניחים את הבקבוק אופקית באינקובטור תרבית תאים ב 37 ° C, 5% CO₂.
   2. תרבית את התאים ב 37 ° C ו 5% CO₂, עד 70% מפגש. זה בדרך כלל צריך להיות מושגת לאחר 24 - 48 שעות.
   3. ברגע שהתאים נפגשים ב-70%, מעבירים את תרחיף תאי NLDC-145 המלא (10 מ"ל) לצינור צנטריפוגה חרוטי בנפח 15 מ"ל באמצעות בקר פיפטה עם פיפטה בטווח נפחים של 1-10 מ"ל. מטילים את התאים בצנטריפוגה על 250 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   4. טרום חם ISF-1 בינוני עד 37 ° C באמבט מים להשעות מחדש את הגלולה ב 12 מ"ל של ISF-1 בינוני בתוספת 1% פניצילין/סטרפטומיצין. מעבירים את תרחיף התא המרחף לבקבוק תרבית תאים טרי (75 ס"מ²).
   5. תרבית והרחבת התאים בתווך ISF-1 בתוספת 1% פניצילין/סטרפטומיצין ב-37°C ו-5%_CO2, עד ל-70% במפגש ו-99% קיימא. זה בדרך כלל צריך להיות מושגת לאחר 48 - 72 שעות.
   6. לפצל את התאים לשני 75 ס"מ² צלוחיות. כדי לעשות זאת, תחילה שטפו את תחתית בקבוק תרבית התא / משטח התרבית עם תרחיף התא כדי להסיר את כל תאי NLDC-145 מפני השטח. יש להעביר 6 מ"ל של תרחיף תאי NLDC-145 כל אחד לאחד משני בקבוקים טריים^{בגודל 75} ס"מ 2 ולהוסיף מדיום ISF-1 שחומם מראש בתוספת 1% פניצילין/סטרפטומיצין עד 12 מ"ל
      הערה: אין לחדש את מדיום תרבית התאים מכיוון שתאי NLDC-145 יתנו את התווך. מעבירים את התאים יחד עם המדיום שלהם וממלאים את התרבית עד לנפח הרצוי בתווך טרי. זה חיוני לכדאיות ולייצור נוגדנים מרבי על ידי תאי NLDC-145.
   7. להרחיב את תרביות התאים ב 37 ° C ו 5% CO₂, עד כ 70% confluent אשר מושגת בדרך כלל לאחר 48 - 72 שעות.
   8. ברגע שהתאים נפגשים ב-70%, מעבירים 10 מ"ל של תרחיף תאי NLDC-145 המורחב מכל אחד^מ-75 ס"מ 2 בקבוקים לבקבוק רולר אחד מסוג PETG (פוליאתילן טרפתאלט גליקול) (1,050 ס"מ²). לשם כך, יש לשטוף את תחתית בקבוק תרבית התא / משטח התרבית עם תרחיף התא כדי להסיר את כל התאים מפני השטח באמצעות בקר פיפטה ופיפטה 10 מ"ל.
   9. הוסף 140 מ"ל של ISF-1 בינוני בתוספת 1% פניצילין/סטרפטומיצין (מחומם מראש ל-37°C) ישירות מהבקבוק הבינוני לכל אחד מבקבוקי NLDC-145 המכילים רולר וממלא אותם עד לסימן 150 מ"ל.
      הערה: ראה הערה בשלב 1.1.6.
   10. תרביתו את בקבוקי הרולר בטמפרטורה של 37°C, 5% CO₂ ו-25 סיבובים לדקה במשך שלושה ימים.
   11. יש להוסיף 150 מ"ל של מדיום ISF-1 בתוספת 1% פניצילין/סטרפטומיצין (מחומם מראש ל-37°C) לכל אחד מבקבוקי ה-NLDC-145 המכילים רולר הממלאים אותם עד ל-300 מ"ל.
   12. תרממו את בקבוקי הרולר המכילים כעת תרבית של 300 מ"ל כל אחד בטמפרטורה של 37°C, 5% CO₂ ו-25 סיבובים לדקה למשך שלושה ימים נוספים.
   13. הוסף עוד 100 מ"ל של מדיום ISF-1 בתוספת 1% פניצילין/סטרפטומיצין (מחומם מראש ל-37°C) לכל אחד מבקבוקי הרולר המכילים NLDC-145, ובכך מלא אותם עד ל-400 מ"ל
   .
   14. תרבית את בקבוקי הרולר המכילים כעת תרבית 400 מ"ל כל אחד ב 37 ° C, 5% CO₂, ו 25 סיבובים / דקה במשך שבעה ימים נוספים.
       הערה: במהלך שבוע זה, התרבית נעשית צפופה מאוד (עד 95% צפיפות) והכדאיות יורדת (עד 50% בלבד), מה שמאפשר שחרור נוגדנים מקסימלי.
2. לטיהור αDEC-205 מהסופרנאטנט של התרבית, יש לשפוך את תרחיף התאים NLDC-145 (משני בקבוקי הרולר) ישירות לתוך בקבוקי צנטריפוגה אוטומטית של 500 מ"ל.
   הערה: יש לאסוף נפח כולל של 800 מ"ל של תרבות.
   1. צנטריפוגה את התרבית במשך 30 דקות ב 8,600 x גרם ו 4 ° C כדי להסיר תאים ופסולת.
   2. אספו את הסופרנאטנטים, השליכו את הכדורים, ואיגמו את הסופרנאטנטים בבקבוק מגיב סטרילי.
      הערה: טיהור של αDEC-205 יכול להתחיל מיד (שלב 2.) או supernatant יכול להיות מאוחסן לטווח קצר ב 4 ° C.

2. טיהור נוגדן αDEC-205 מתא NLDC-145 supernatant

הערה: מתא NLDC-145 supernatant, αDEC-205 מטוהר באמצעות עמודת חלבון G Sepharose (לשימוש חוזר). מידות העמודות הן 15 מ"מ x 74 מ"מ וחלבון G ספרוז 5 מ"ל ארוזים בכל עמודה.

1. להכנת ושטיפה של עמוד החלבון G Sepharose, יש לשים פקק גומי אטום על הפתח העליון של עמוד החלבון G Sepharose. נקב את תקע הגומי בשתי צינוריות סטריליות (20 G x 1 1/2", 0.90 x 40 מ"מ).
   1. חבר מזרק 10 מ"ל לאחת משתי הצינוריות וצינור סיליקון גמיש (כ 100 ס"מ אורך, 2.5 - 3 מ"מ קוטר) עם מחבר צינורות לצינורית השנייה.
      הערה: מבנה המזרק/תקע הגומי ניתן לשימוש חוזר ומספק ואקום וכתוצאה מכך זרימה רציפה של נפח גדול של תרבית סופרנאטנט לעמודת החלבון G Sepharose. לשם כך, משוך מעט לאחור את הבוכנה של המזרק כדי להבטיח זרימת נוזלים רציפה בשלבים הבאים.
   2. שטפו את העמוד עם 50 מ"ל של 0.1 M חומצה אצטית קרחונית (pH 2) כדי להסיר נוגדנים שעלולים להישאר מכל טיהור נוגדנים קודם. שים את קצה צינור הסיליקון בבקבוק מגיב מלא חומצה אצטית קרחונית 0.1 M (pH 2). כתוצאה מהוואקום המושרה, 50 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית 0.1 M (pH 2) עוברים דרך החלבון G Sepharose column.
      הערה: 0.1 M חומצה אצטית קרחונית (pH 2) יש לאחסן בבקבוק מגיב או למלא טרי בכד.
   3. שטפו את העמוד במי מלח חוצצי פוספט (PBS) בנפח 100-200 מ"ל. הכניסו את קצה צינור הסיליקון לבקבוק מגיב מלא PBS או לכוסית. תן 100-200 מ"ל PBS לרוץ טיפה דרך עמודת חלבון G Sepharose.
2. לטיהור נוגדנים מהסופרנטנט NLDC-145, יש להעמיס 800 מ"ל של הסופרנאטנט NLDC-145 (המתקבל משלב 1.2.2.) על העמודה. הכניסו את קצה צינור הסיליקון לבקבוק ריאגנטים מלא סופר-נטנט NLDC-145. תן 800 מ"ל NLDC-145 supernatant לרוץ טיפה דרך העמודה.
   1. לשטוף את העמוד עם 500 מ"ל של PBS. שים את קצה צינור הסיליקון בבקבוק מגיב מלא PBS או כד. תן PBS 500 מ"ל לרוץ טיפה דרך העמודה.
   2. להדבקה, יש להשתמש ב-20 צינורות 1.5 מ"ל ופיפטה 100 μL של 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) לכל צינור של 1.5 מ"ל. הסר את תקע הגומי מהעמוד והפיפטה 1 מ"ל של 0.1 M גליצין (pH 3) לתא העליון של עמודת החלבון G Sepharose כדי להוציא את הנוגדן מהעמודה. לאסוף את הזרימה ישירות כמו eluate באחד צינורות 1.5 מ"ל מוכן.
   3. חזור על שלב האלוציה (2.2.2.) עבור כל 20 הצינורות (1.5 מ"ל).
   4. קבע את הצפיפות האופטית של כל שברי האלוציה ב- 280 ננומטר (OD₂₈₀) באמצעות ספקטרופוטומטר על מנת לזהות את השברים המכילים נוגדנים.
      הערה: השתמש בשבר האלוציה הראשון כריק.
   5. אחסן את כל השברים עם OD₂₈₀ גדול מ- 0.5 (כ- 10 שברים).
   6. אחסנו את עמודת החלבון G Sepharose מלאה באתנול 20% בטמפרטורה של 4°C.
3. נטרל את האלוטציות המצטברות כנגד PBS של 1000 מ"ל (בכד של 2000 מ"ל) ב -4 מעלות צלזיוס למשך הלילה באמצעות צינורות דיאליזה עם חיתוך משקל מולקולרי (MWCO) של 12 - 14 kDa.
   1. חותכים את צינורות הדיאליזה לחתיכות של 20 ס"מ. מרתיחים את צינורות הדיאליזה ב 500-800 מ"ל של 10 mM EDTA (pH 7.5) במשך 30 דקות בכוס באמצעות פלטה חמה כדי להסיר זיהום. יש להשליך את תמיסת 10 mM EDTA (pH 7.5) ולהרתיח את צינורות הדיאליזה במים נטולי יונים, למשך 10 דקות.
      הערה: ניתן להשתמש בצינורות הדיאליזה ישירות או לאחסן בתמיסת 0.01% נתרן אזיד (NaN₃)/H₂O ב-4°C עד לשימוש הבא.
   2. סוגרים את תחתית צינור הדיאליזה עם סגירת צינורות דיאליזה מתאימה/מקשה אחת, מהדק צירים ומכניסים בזהירות את יציאת הנוגדנים לתוך צינור הדיאליזה. סגור את החלק העליון של צינורות הדיאליזה עם מהדק שני.
   3. מקבעים את המהדק העליון של צינור הדיאליזה למעמד צף, מחברים אותו עם מוט ערבוב מגנטי לתוך הכד המלא PBS, ומניחים את הכד על מערבל מגנטי.
   4. יש לדיאליזה למשך הלילה, תוך ערבוב ב-4°C.
4. כדי להגדיל את הריכוז של αDEC-205, לטעון את הדיאליזה המלאה לרכז צנטריפוגלי עם 10 kDa MWCO. פתח מהדק אחד של הצינור וטפט בזהירות את הדיאליזה המלאה מתוך צינור הדיאליזה לתוך הרכז הצנטריפוגלי (10 kDa MWCO).
   הערה: אין לגעת בתחתית הרכז עם קצה הפיפטה.
   1. צנטריפוגה למשך 30 דקות ב-693 x גרם (2,000 סל"ד) ו-4°C.
   2. טען את הרכז הצנטריפוגלי עם 10 מ"ל PBS וצנטריפוגה ב 693 x g (2,000 סל"ד) ו 4 ° C עד נפח הסופי של תמיסת נוגדנים שנותרה הוא 1-1.5 mL.
      הערה: במידת הצורך, חזור על שלב הצנטריפוגה של 2.4.1. כדי להתאים לכמות הרצויה.
   3. באמצעות ספקטרופוטומטר, קבע את הצפיפות האופטית של תמיסת αDEC-205 המרוכזת ב- 280 ננומטר (OD₂₈₀). השתמש ב- PBS כריק.
   4. חשב את הריכוז של αDEC-205 באמצעות הנוסחה הבאה:
      ריכוז [mg/mL] = OD₂₈₀/1.4.
   5. סנן את תמיסת αDEC-205 באמצעות יחידת מסנן מזרקים 0.22 מיקרומטר.
      הערה: טיהור αDEC-205 מסופרנאטנט תאי היברידימה NLDC-145 יכול להיות מושג גם על ידי FPLC (כרומטוגרפיה נוזלית מהירה של חלבון). αDEC-205 מטוהר ניתן לאחסן ב 4 ° C או ב -18 ° C לאחסון לטווח ארוך.

3. צימוד כימי של OVA ל- αDEC-205

הערה: נדרש יחס של 0.5 מ"ג חלבון OVA ל-2.5 מ"ג αDEC-205 (1:5) לצמידות כימית אופטימלית. עם זאת, יחס זה יכול להשתנות עבור חלבונים ונוגדנים אחרים ויש למטב אותו עבור מצומדים חלופיים. הפחתת הקשרים הדיסולפידים של חלבון OVA מתבצעת באמצעות דגירה עם 30 mM TCEP-HCl, אשר חושף את קבוצות sulfhydryl עבור צימוד כימי αDEC-205 ו 240 μl של TCEP-HCl נדרשים בשלב 3.2. שני השלבים, הפחתה הנגרמת על ידי TCEP של OVA (שלב 3.1.) והפעלת sulfo-SMCC של αDEC-205 (שלב 3.2.) צריכים להתבצע במקביל.

1. להכין טרי 125 mM TCEP-HCl פתרון (pH 7.0). שקלו את הכמות הרצויה של TCEP-HCl והמיסו את TCEP-HCl בבסיס Tris של 0.9 M (pH 8.8). השתמש בפסי מחוון pH כדי לבדוק את ה- pH של תמיסת TCEP-HCl של 125 mM (שאמורה להיות ניטרלית) וכוונן את ה- pH עם בסיס Tris (pH 8.8).
   1. פיפטה 200 μL תמיסת חלבון OVA (המכילה 0.5 מ"ג OVA) לתוך צינור סטרילי 1.5 מ"ל. הוסף 240 μl 125 mM TCEP-HCl ו- 560 μL של מים אולטרה-טהורים סטריליים לחלבון OVA באמצעות פיפטה לריכוז סופי של 0.5 מ"ג / מ"ל חלבון OVA ו 30 mM TCEP-HCl (OVA / TCEP-HCl).
      הערה: 2.5 מ"ג EndoGrade OVA (lyophilized) מומס ב-PBS של 1 מ"ל והתוצאה היא תמיסת OVA של 2.5 מ"ג/מ"ל.
   2. יש לדגור על ה-OVA/TCEP-HCl המתקבל בטמפרטורת החדר למשך 1.5 שעות<בר/> הערה: אין להאריך שלב דגירה זה.
2. כדי להפעיל αDEC-205 לצמידה, יש להמיס 2 מ"ג sulfo-SMCC ב-100 μL של מים אולטרה-טהורים.
   הערה: Sulfo-SMCC רגיש הידרוליזה. לכן, כמויות גדולות יותר של sulfo-SMCC מומס צריך להיות מטופל במהירות או זמין 2 מ"ג aliquots יש להשתמש.
   1. לדלל αDEC-205 ב PBS כך 2.5 מ"ג הוא הכיל 900 μL.
   2. יש לערבב 2.5 מ"ג של αDEC-205 (נפח של 900 מיקרוליטר; המתקבל משלב 3.2.1.) ו-100 מיקרוליטר של סולפו-SMCC (המתקבל משלב 3.2.) בצינור של 1.5 מ"ל, והתוצאה היא נפח כולל של 1 מ"ל.
   3. דגור על תמיסת αDEC-205/sulfo-SMCC למשך 30 דקות ב-37°C ו-550 סל"ד בבלוק חימום.
3. בעקבות דגירות אלה, עודפי סולפו-SMCC ו-TCEP-HCl מוסרים מיד מהתמיסות באמצעות עמודות התפלה (MWCO 7 kDa; נפח עמודה 5 מ"ל).
   1. סובב את הסגירה התחתונה של העמודים (MWCO 7 kDa), שחרר את המכסה והכנס את העמוד לצינור חרוטי בנפח 15 מ"ל.
   2. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 1,000 x גרם בטמפרטורת החדר כדי להסיר את הנוזל.
   3. מניחים את העמוד בצינור חדש ומסירים את המכסה. טען באיטיות את הנוגדן/סולפו-SMCC ואת ה-OVA/TCEP-HCl, בהתאמה, למרכז מצע השרף הקומפקטי של עמודה אחת כל אחד.
   4. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 1,000 x גרם בטמפרטורת החדר.
   5. מחק את העמודות לאחר השימוש. התמיסות המכילות נוגדנים ו-OVA המיועדות לצמידות נמצאות בצינורות.
   6. מיד לערבב את שני הפתרונות על ידי pipetting עבור צימוד של αDEC-205 ו OVA.
   7. יש לדגור על תערובת αDEC-205 ו-OVA המתקבלת למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
4. לאחר הצמידה, עודף OVA לא קשור מוסר מהתמיסה ו- αDEC-205/OVA המצומד מרוכז באמצעות רכז חלבון צנטריפוגלי (MWCO 150 kDa).
   1. יש לשטוף מראש את רכז החלבון הצנטריפוגלי (MWCO 150 kDa) על ידי פיפטציה של 12 מ"ל PBS על העמוד וצנטריפוגה למשך 2 דקות בטמפרטורה של 2,000 x גרם בטמפרטורת החדר.
      הערה: במידת הצורך, חזור על שלב הצנטריפוגה (3.4.1.) עד שנפח של כ -5 מ"ל עבר דרך העמודה.
   2. לפני טעינת αDEC-205/OVA על רכז החלבון הצנטריפוגלי, שמור דגימה של 20 μL של αDEC-205/OVA הלא מרוכז לניתוח כתמים מערביים. אחסן aliquot זה ב 4 °C עד לניתוח.
   3. טען את αDEC-205/OVA על רכז החלבון הצנטריפוגלי על ידי pipetting.
      הערה: הימנע מכל מגע עם המיטה של החדר העליון של רכז צנטריפוגלי.
   4. מלא את הרכז עד 15 מ"ל עם PBS וצנטריפוגה את הרכז למשך 5 דקות ב 2,000 x גרם בטמפרטורת החדר.
   5. שמור מדגם של הזרימה (flow-through I) לניתוח כתמים מערביים והשלך את יתרת הזרימה.
   6. מלא את הרכז עד 10 מ"ל עם PBS וצנטריפוגה את הרכז במשך 8 דקות לפחות ב 2,000 x גרם בטמפרטורת החדר.
   7. שמור דגימה עבור הזרימה השנייה (flow-through II) לניתוח כתם מערבי ומחק את יתרת הזרימה.
   8. לאחר השגת ההעשרה הרצויה (סביב 1.5 מ"ל של תמיסת αDEC-205/OVA יש להשאיר בחדר העליון) לשאוף בעדינות את הדגימה המרוכזת.
      הערה: אם נשאר יותר מדי נוזל בחדר העליון, ניתן לחזור על הצנטריפוגה אך יש לשמור עליה קצרה ככל האפשר.
5. קבע את ריכוז החלבון של αDEC-205/OVA המתקבל באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח. השתמש ב- PBS כריק.
6. סנן את αDEC-205/OVA באמצעות יחידת מסנן מזרקים 0.22 מיקרומטר.
   הערה: לניתוח מאוחר יותר ולניסויים in vivo, αDEC-205/OVA ניתן לאחסן ב -4 ° C או -18 ° C.

4. אימות הצמידות הכימית על ידי ELISA

1. בצע ELISA לאימות נוסף של צימוד כימי מוצלח וכתוצאה מכך αDEC-205/OVA.
2. מצפים צלחת ELISA מתאימה של 96 בארות עם 100 μL/well של 3 ng/μL ארנב αOVA נוגדן בחיץ ציפוי (0.1 M סודיום ביקרבונט (NaHCO₃) pH 9.6 מדולל ב H₂O).
   1. לדגור את הצלחת לילה ב 4 °C (75 °F).
3. לאחר הציפוי, שטפו את הצלחת שלוש פעמים עם PBS, למשל באמצעות מכונת כביסה ELISA.
4. חסום את הצלחת על ידי זילוף 200 μL של חיץ חוסם (10% FCS ב- PBS) בכל באר של הצלחת ודגר על הצלחת במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
5. דילול סדרתי αDEC-205/OVA (מתקבל משלב 3.6.) 1:2 בחיץ חוסם (10% FCS ב-PBS) כדי להשיג דילולים הנעים בין 6 מיקרוגרם/מ"ל עד 93.8 ננוגרם/מ"ל αDEC-205/OVA ולהוסיף 100 מיקרוליטר/באר של כמויות יורדות אלה של αDEC-205/OVA לבארות.
   1. דוגרים על הצלחת במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
6. שטפו את הצלחת שלוש פעמים עם PBS, למשל באמצעות מכונת כביסה ELISA.
7. הוסף 100 μL של נוגדן αrat-IgG+IgM(H+L)-HRPO של העז (מדולל ל-1:2,000 בחיץ חוסם (10% FCS ב-PBS)) לכל באר של הצלחת.
   1. יש לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
8. שטפו את הצלחת שלוש פעמים באמצעות PBS, למשל באמצעות מכונת כביסה ELISA.
9. הוסף 50 μL של מצע HRPO לבארות. כאשר מתבוננים בתגובת צבע ברורה, עצור את התגובה באמצעות תוספת של 150 מיקרוליטר תמיסת עצירה (1M H₂SO₄) לכל באר.
10. לאחר 5 דקות, ספיגת קריאה ב-450 ננומטר באמצעות קורא ELISA.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מאגר חוסם (ELISA)			10% FBS ב- PBS
בקבוק תרבית תאים T25	גריינר ביו-וואן	690175	אנו משתמשים בצלוחיות סטנדרטיות של תרבית תאים עם מכסה מסנן CELLSTAR; לחלופין משתמשים בבקבוק תרבית תרחיף (690195 )
בקבוק תרבית תאים T75	גריינר ביו-וואן	658175	אנו משתמשים בצלוחיות סטנדרטיות של תרבית תאים עם מכסה מסנן CELLSTAR; לחלופין משתמשים בבקבוק תרבית תרחיף (658195)
בקבוק תרבית תאים T175	גריינר ביו-וואן	661175	אנו משתמשים בצלוחיות סטנדרטיות של תרבית תאים עם מכסה מסנן CELLSTAR; לחלופין משתמשים בבקבוק תרבית תרחיף (661195)
רכז צנטריפוגלי MWCO 10 kDa	סרטוריוס	VS2001	Vivaspin 20 רכז צנטריפוגלי
רכז חלבון צנטריפוגלי MWCO 100 kDa, 5 - 20 מ"ל	תרמו פישר סיינטיפיק	88532	רכז חלבון פירס, PES 5 -20 מ"ל; אנו משתמשים ברכז פירס 150K MWCO 20mL (מספר קטלוגי 89921), אשר אינו זמין עוד
בקבוקי צנטריפוגות	נלג'ין	525-2314	PPCO (פוליפרופילן קופולימר) עם סגירת בורג PP (פוליפרופילן), 500 מ"ל; מתקבל מ VWR, גרמניה
חיץ ציפוי (ELISA)			0.1 M סודיום ביקרבונט (NaHCO3) ב H2O (pH 9.6)
עמודות התפלה MWCO 7 kDa	תרמו פישר סיינטיפיק	89891	עמודי התפלה ספין Zeba Thermo Scientific 7K, MWCO 7K, 5 מ"ל
מגיב זיהוי ELISA (מצע HRPO)	סיגמא-אולדריץ'/מרק	T8665-100ML	3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) מערכת מצע נוזלי
ELISA צלחת 96 באר	תרמו פישר סיינטיפיק	442404	MaxiSorp Nunc-Immuno צלחת
נסיוב עגל עוברי	פאן-ביוטק	עמ' 40-47500	FBS פורטה טובה
ISF-1 בינוני	Biochrom/bioswisstec	פ 9061-01
NLDC-145 היברידיומה	ATCC	HB-290	אם עדיין לא בהישג יד, ניתן לרכוש את תאי ההיברידיומה מ-ATCC
אובאלבומין	Hyglos (באמצעות BioVendor)	321000	EndoGrade OVA ultrapure עם <0.1 האיחוד האירופי/מ"ג
פניצילין/סטרפטומיצין	תרמו פישר סיינטיפיק	15140122	Gibco פניצילין/סטרפטומיצין 10.000 U/ml; לחלופין ניתן להשתמש בגיבקו פניצילין/סטרפטומיצין 5.000 U/ml (15070-063)
בקבוקי רולר תרבית תאי פוליאתילן טרפתאלט גליקול PETG	Nunc In Vitro	734-2394	מצופה PDL סטנדרטי, מאוורר (1.2X), 1050 סמ"ר, נפח 100 - 500 מ"ל; מתקבל מ- VWR, גרמניה
רצועות מחוון pH	מרק	109535	רצועות מחוון pH 0-14
נוגדן עז רב-שבטי αrat-IgG+IgM-HRPO (ELISA)	ג'קסון מחקר חיסוני	112-035-068	הושג מדיאנובה, גרמניה; שימש בשעה 1:2000 עבור ELISA
ארנב רב-שבטי αOVA (ELISA)	אבקאם	ab181688	בשימוש ב-3 ננוגרם/מיקרוליטר
חלבון G עמודת ספארוז	מרק/מיליפור	עמ' 3296	5 מ"ל חלבון G Sepharose, זרימה מהירה ארוזים על עמודה ריקה PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)
תקע גומי	אומנילאב	5230217	פקקי גומי DEUTSCH &NEUMANN (תחתון Φ 17 מ"מ; עליון Φ 22 מ"מ)
צינור סיליקון	אומנילאב	5430925	DEUTSCH &; NEUMANN (בתוך Φ 1 מ"מ; חיצוני Φ 3 מ"מ)
דק-מהיר			השתמשנו בשוקולד סלים-מהיר רגיל הזמין באופן חופשי בבית המרקחת מכיוון שבגישת הכתם המערבי הזה הוא הניב תוצאות טובות יותר מאבקת חלב
פתרון עצירה (ELISA)			1M H2SO4
סולפו-SMCC	תרמו פישר סיינטיפיק	22322	פירס סולפו-SMCC Cross-Linker; לחלופין השתמש במספר קטלוגי A39268 (10 x 2 מ"ג)
יחידת מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר	מרק/מיליפור	SLGV033RS	יחידת מסנן מזרקים Millex-GV, 0.22 מיקרומטר, PVDF, 33 מ"מ, מעוקר גמא
מזרק 10 מ"ל	אומנילאב		מזרקים חד פעמיים Injekt® סולו B.Braun
צינוריות סטריקניות®	ב. בראון		סטריקן® G 20 x 1 1/2"; 0.90 x 40 מ"מ; צהוב
TCEP-HCl	תרמו פישר סיינטיפיק	A35349
מחבר צינורות	אומנילאב		מחברי צינורות זעירים של קליינפלד לצינור סיליקון